▲7月0-日，同写意将在苏州金鸡湖畔举办第二届全球生物技术前沿千人大会，汇聚百余位新药领军人物，点击查看。
在国内CAR-T领域，复星凯特可谓拔得头筹，并且预示着我国免疫治疗进入了又一世代。CAR-T疗法作为有别于传统药物的“活药”，不仅对复发、难治性肿瘤患者表现出了突破性疗效，其生产体系和使用场景（不具备除菌过滤的特性）也有别于普通药物，市场上对其应用范围与前景仍报有诸多疑问与不解。鉴于当下生物技术的更新速度，预计CAR-T疗法还将带给市场更多惊喜。
同时，从药明巨诺、复星凯特引进国外生产工艺和质量控制体系后到本次正式报产，我国监管机构对整个生产过程以及无菌性保证有了更充分的认识，近期发布的《GMP附录细胞治疗产品》、《人用基因治疗制品总论-中国药典》直接提高了ATMP行业门槛，行业将逐步淘汰不达标企业，行业龙头将开始确立。
本报告拟从CAR-T疗法技术入手，分析CAR-T疗法的局限性及研发方向、制备上工艺以及商业化前景。
Car-T，肿瘤治疗的下一代疗法
如果把近代医学比作人类文明发展的皇冠，免疫治疗（通过激发人体免疫系统从而识别和杀死恶性肿瘤细胞的治疗）可谓是皇冠上的一颗璀璨的明珠，免疫疗法的发展彻底改变了传统癌症治疗的手段，扩展了医生们的治疗手段。癌症免疫疗法多种多样，包括单克隆抗体、淋巴细胞活化细胞因子、癌症疫苗、溶瘤病毒、双特异性抗体、过继性T细胞疗法，这些治疗手段都是癌症治疗领域发展的热点，并且拥有极大提升患者愈后甚至痊愈的可能性。近年来，随着癌症治疗检测技术不断提升，新靶点、新机理不断发现，各类免疫治疗快速发展，Car-T疗法更可谓其中佼佼者。
由于T细胞是体内抗癌的主力，T细胞治疗一直被认为是治愈癌症最具前景的方向之一。由于T细胞受体（TCR）一般在主要组织相容性复合体MHC出现的情况下才能被激活，而肿瘤细胞有调低MHCclassI分子表达的能力从而避免被免疫系统识别，肿瘤细胞也能逃过TCR的识别。为了克服TCR的这一限制，嵌合抗原受体（Car）就这样应运而生。
Car-T（ChimericantigenreceptorTcell，嵌合抗原受体T细胞）疗法，是指通过基因克隆技术对具有免疫球蛋白（Ig）的抗原结合区的T细胞受体的进行基因改造，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，使T细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活。
Car的基本结构包括一个肿瘤相关抗原（tumor-associatedantigen,TAA）结合区（通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的ScFv段），一个胞外铰链区（Hingarea），一个跨膜区（Transmembraneregion）和一个胞内免疫受体酪氨酸活化基序（Immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM）。嵌合抗原受体（Car）是Car-T的核心部件。
TAA大量在于肿瘤细胞膜表面，较少正常组织中表达。不同TAA可以作为Car-T细胞的靶抗原，对Car-T起定向作用。靶抗原的选择对于Car的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性等都是关键的决定因素。因此，选择合适的靶点蛋白，是Car-T细胞免疫治疗在肿瘤临床研究应用中的一个重要挑战。
CD分子表达作为表面标志物可用于细胞类型鉴定，以CD9为靶点的Car-T细胞的临床研究是目前各国Car-T研究中最热门的靶点。除了CD9这个被广泛报道的靶点外，许多肿瘤相关靶点已进入I期和II期临床试验。在目前已注册的临床试验和已发表的研究结果中，B细胞成熟抗原（BCMA）已被提出作为一个特别重要的靶点。目前Car-T细胞治疗的临床试验主要集中在CD9，CD20，CD22，GPC3（Glypican-3），BCMA和其他有希望的靶点。
而今已过而立岁，Car-T发展历程
Car-T疗法最早由Gross等于上世纪80年末提出，至今已有30余年的发展历程，是目前过继性T细胞治疗中发展最为成熟的技术之一，FDA在年批准了首个CAR-T细胞治疗产品，更是正式宣告了Car-T技术的产业化成熟。
年的8月30日，人类抗癌历史上发生了一个值得铭记的大事件，在这天美国食品和药物管理局（FDA）批准诺华公司的突破性CAR-T免疫疗法Kymriah，成为全球第一个获批的CAR-T细胞治疗产品，用于治疗难治性，或出现二次及以上复发的25岁以下的B细胞急性淋巴细胞白血病患者，定价47.5万美元。
在FDA发布的批文的开头，写着这样一句话：“今天，美国FDA做了一个历史性的决定，在美国境内批准了第一个基因治疗产品，给癌症等其他严重威胁生命的疾病开辟了全新的治疗途径。”
年0月8日，KitePharma的CAR-T产品YesCarta（axicabtageneciloleucel，KTE-C9）经美国FDA批准上市，用于治疗成人复发或难治性大B细胞淋巴瘤。YesCarta是全球第二款获批上市的CAR-T产品，同时也是第一个用于治疗非霍奇金淋巴瘤的CAR-T产品。
两款Car-T产品的获批，给本就已经火热的免疫治疗市场又注射了一剂强心剂。尽管获批的两款二代Car-T仍有许多不足之处，但其产品本身令人瞠目的疗效，令市场为之疯狂。
从技术发展的角度来说，Car技术不断革新.目前Car技术已经发展到了第五代（我们所熟悉的诺华与吉利德均为二代）。了解每一代Car技术的特点与进步点将有助于我们更好地了解Car-T技术的应用尤其是在减少副作用、实体瘤治疗方面的应用。如前文所述，Car基因包含表达识别特异性抗原的单克隆抗体的重链和轻链的单链可变片段（ScFv）的序列。ScFv中的可变重链和轻链通过短肽连接在一起。除ScFv外，CAR还包含一个铰链，旨在支持ScFvs，跨膜结构域和信号传导内结构域，这些结构域可启动细胞内信号级联反应而进行抗原识别。具体来看：
从第一到第三代CAR
第一代CARs不包含共刺激分子。包括第一代、第二代和第三代CARs在内的所有CARs都装有将scFv与细胞内信号结构域连接的铰链。铰链通常来自CD8α糖蛋白或IgG恒定域。CD8α铰链可以通过其疏水性跨膜结构域透过细胞膜。跨膜结构域的一部分可能包含共刺激分子的序列。最后，跨膜结构域与融合内分裂素融合蛋白进行融合。融合内分裂素融合蛋白是由共刺激分子组成并融合FcεRIγ链或CD3ε或CD3ζ信号域。共刺激分子通常包含融合有源自CD3ε序列胞内信号传导域的CD28或4-IBB或OX-40。
除scFv之外，第三代CAR还包含融合有单链单载体上（例如逆转录病毒载体）或双链单载体上（例如逆转录病毒、慢病毒载体）CD3ζ内结构域的两个共刺激分子。裂解后的双链单载体表达两条链，其中一条链含有融合有共刺激分子和CD3ζ内域的scFv，而另一条链可能会产生融合有共刺激分子，但没有CD3ζ内域的scFv。
第一代CAR的组织结构：（A）编码ScFv片段的第一代CAR的嵌合基因序列、可识别肿瘤相关抗原的抗原结合区、铰链、跨膜结构域（TM）和信号域，例如CD3ζ。第一代CARs没有共刺激分子，但包含细胞内信号域。（B）第一代嵌合CAR在T细胞中的表达。使用各种基因转染方法在T细胞中表达嵌合基因序列。T细胞中的嵌合基因序列通过蛋白质翻译后表达不干扰内源性T细胞受体的功能齐全的CAR。（C）在T细胞中表达时，第一代CAR可变区的放大视图。
年，第一代基于CD3-ζ链的CAR-T细胞被发展出来。该CAR-T细胞虽然具有激活T细胞的特点，但是只含有激活受体CD3-ζ，其抗肿瘤效果比较弱，在体内的持续扩增有限，不具备大规模杀灭肿瘤细胞的能力。
第二代CAR的组织结构:（A）第二代CAR的嵌合基因序列。第二代CAR融合有一个共刺激分子、CD28/4I-BB。但是，还融合了其他几种共刺激分子，例如OX40和ICOS。（B）第二代嵌合CAR在T细胞中的表达。采用各种基因转染的方法表达编码嵌合基因序列的质粒。T细胞中的嵌合基因序列通过蛋白质翻译后表达含有胞外区、跨膜区和内源性共刺激信号区的功能齐全的CAR。内源性T细胞受体保持不受干扰。（C）在T细胞中表达时，第二代CAR部分区域的放大视图。
第三代CARs：尽管在小鼠抗肿瘤模型上CD28和4-BB具有类似的活性，但是CD28CAR-T表现出了更多的增殖，而4-BBCAR-T显示有更持久的活性。第三代CARs在胞内信号结构域加上了第二个共刺激分子。因此，scFv结合TAA后激活了CD3ε第一信号和以两个共刺激分子信号为通路的第二信号。CD28结合4-BB或CD28结合OX40作为共刺激分子在第三代的CAR-T中最为常见。截至目前，少许第三代CAR-T已经进入临床试验，其相对于2代CAR-T的优越性还需要进一步评估。理论上，只要TAA在癌细胞表面表达，CAR-T就可以识别。然而由于实体瘤表型的异质性，一些癌细胞不能被CAR-T识别，这就大大降低了CAR-T治疗的几率。
第四代CAR与新颖的第五代CAR
第四代CAR-T细胞，被称为宇宙级的细胞因子介导杀手，是被设计成将在CAR与靶向抗原结合时能够释放改造基因的产品到肿瘤组织中。免疫调节分子如促炎症、细胞因子和酶的局部转移，使得T细胞浆免疫抑制肿瘤微环境转化为免疫耐受性肿瘤微环境。一种经常在CAR-T细胞中被过度表达的细胞因子是IL-2，它是一个非常有效的分子可以增强T细胞分泌IFNy、granzymeB和穿孔素perforin；并雇佣NK细胞去消除CAR不能识别的肿瘤细胞。与传统的CAR相比，IL-2过表达的CAR-T细胞在临床前的模型中表现出增强的抗肿瘤和扩增效果，尤其是在实体瘤模型中。
最近，一种新颖的CAR被设计和开发出来，它沿用了第二代CAR的主干链增加了在CD3和CD28信号区域之间的IL-2受体域，同时在C末端的CD3处结合YXXQ序列。第五代的CAR的设计旨在同时激活TCR，共激域CD28，和细胞因子三重信号；因为这是T细胞结合抗原时被激活的前提条件。作者证实了在血液肿瘤和实体瘤模型中，与第二代CAR相比，第五代CAR通过基因改造增强了T小的增值、存活已经抗肿瘤效果。
雄关漫道真如铁
Car-T在适应症拓展方面的进展
尽管Car-T已经获批了以B细胞上CD9为靶点的DLBCL、PMBCL以及ALL在内三个适应症，同时，年2月3日Kite向FDA递交其KTE-X9的生物制剂许可申请（BLA）（用于治疗复发或难治套细胞淋巴瘤MCL），但市场上对Car-T主要的担忧在于其靶点较少（多集中于CD9、BCMA）、适应症仍较少。下文将分享Car-T在CD9以外的血液瘤靶点以及实体瘤方面的进展。
CD9以外的血液瘤靶点
目前，Car-T在血液瘤的研究相对更为成熟，全球开展了大量临床试验探索CD9外的新靶点。目前有应用价值的针对恶性B细胞肿瘤的临床前和临床靶标还包CD22、CD20,ROR,CD37和kappa轻链，CD38、BCMA,SLAMF7,CD38、整合素β7。
Car-T在实体瘤领域的挑战与进展
a.实体瘤的治疗充满了挑战
在实体肿瘤中，CAR-T细胞必须跨越多个障碍才能到达肿瘤部位。趋化因子受体错配可以阻止移行淋巴细胞遵循趋化梯度；内皮细胞上的选择素（Selectins）等表面标记物与循环淋巴细胞结合，并诱导信号级联，以便随后向炎症部位外渗是必要的；T细胞上的相应受体也是必要的。此外，肿瘤相关成纤维细胞（CAFS）和肿瘤部位血管异常等物理屏障可以阻止T细胞进入。
多种方案正在试图突破Car-T实体瘤困境。正是由于实体瘤肿瘤微环境强烈的免疫抑制环境作用和细胞膜表面缺乏特异性肿瘤抗原，将CAR-T疗法应用在实体瘤的治疗并没有得到很好的临床获益。
幸运的是，为克服这些挑战，业界在开发新的策略，应用高度创新并且安全的技术，例如）与免疫抑制剂结合使用；2）识别组合抗原策略；3）为CAR-T细胞装备免疫调节因子；4）多靶CAR设计。具体而言，对PD-/CTLA4抑制轴的识别是关键肿瘤微环境介导的免疫抑制因子，这一研究推动了非传统的研究策略，包括基因沉默技术、抑制性截短受体和使用单克隆抗体检查抑制剂破坏抑制机制的联合疗法。
此外，为CAR-T细胞装备免疫调节因子，例如细胞因子、Ab衍生的检查点抑制剂、或者表达第五代CARs，这些策略都将进一步增强调节肿瘤微环境的可行性，将免疫抑制环境转化为免疫允许环境。
实体瘤约占了所有人恶性肿瘤的90%，征服实体瘤才能为更多患者带来希望。因此，实体瘤的Car-T方案一直是学界和研究者希望有所进展的领域。截至年3月5日，全球所有开展的Car-T实验中，针对实体瘤的试验数约占到总实验的27%左右。
b.Car-T实体瘤上进展
目前，尽管实体瘤癌细胞存在大量异质性与演进性，但“石以砥焉，化钝为利”，实体瘤Car-T仍是众多肿瘤研究者与医生们积极探索的领域，已经有诸多针对实体瘤的Car-T临床试验在全球展开，并且展现出了不错的前景。
同时，还有一些极具潜力的新靶点新机制有望助力Car-T攻克实体瘤，未来CART技术在实体瘤方面的治疗效果值得期待；利用CAR-T疗法进行术后循环系统治疗，最终达到预防肿瘤转移或复发的效果也是一个充满希望和挑战的领域。
路修远以多艰兮
Car-T临床副作用与解决方案
Car-T的不良反应是临床使用时不容忽视的问题。CAR-T细胞疗法在血液肿瘤中的临床获益没有受到质疑，但在治疗过程中产生的细胞因子释放综合征和神经毒性等是不能被忽视的，有时甚至是致命的。一般而言3级以上的不良反应主要包括细胞因子释放综合征（CRS）、中性粒细胞减少、和神经毒性事件。细胞因子综合征和神经毒性是在CAR-T细胞疗法中最常被报道的毒性反应，有时甚至会造成患者死亡。细胞因子风暴症状CRS分为轻度和重度，轻度主要反映为发烧、低血压、心动过速、低氧、疲劳，而重度CRS弥散性血管凝血、多器官损伤如干毒性、肾衰竭、心血管疾病等。
另一方面，CAR-T细胞治疗应用在血液系统恶行肿瘤中，会出现非肿瘤细胞的B细胞再生障碍的毒性反应，但这一副作用是较为可控的，临床上主要通过定期让患者注射球免。
Car-T的使用经验不断积累，不良反应不再是主要限制因素。随着Car-T使用的推广，虽然这些副作用仍然存在，但在厂商的指导下（FDA要求Car-T医院进行，且厂商需要对临床医生进行培训），临床医生已积累了很多临床经验去控制，临床毒副作用不再使用CAR-T的主要限制因素。
另外，现在各厂家在生产制备时比之前更有经验，对发生3级以上CRS的比例和中枢毒性会重点考量，产品在问世之前就已得到了较好的控制。再者，在CAR-T临床应用过程会有各种各样的新发现，如为CAR-T加“开关”、在预处理方面探寻更合适的剂量，这些发现会使CAR-T产品的副作用变得更可控、更安全。
在Car-T本身设计上，一些创新的策略正在被评估。提高其安全性和控制CAR-T细胞的超生理活性至关重要。在探索和追求安全性效果更好的需求下，一些创新的策略正在被评估，如在CAR中设计开关控制系统（如iCasp9系统、能被EGFRmAb识别的huEGFRt、Folate-FITC等）、多抗原识别组件、对免疫为环境敏感的组件（遮掩肽加上蛋白酶切断链接子等）。
祸兮福所依
复杂的生产工艺筑Car-T高壁垒
目前，工业界仍然没有开发出一个成熟的，完全可被接受的Car-T生产工艺过程，许多Car-T产品使用人工操作，非常耗时耗力，而且难以扩大，且失败率很高（成功率最高的吉利德在ZUMA-中也有近0%）。自体Car-T的制备过程一般包括一些基本的步骤:首先，病人的白细胞（WBCs）通过血细胞去除法分离后洗涤获得。然后，T细胞被激活，转导Car基因，扩增到一定数量后灌装和密封后用于治疗。经过一定质控，患者经过预处理后，将Car-T细胞注射到患者体内。整个CAR-T工艺非常复杂，生产工艺过程也在不断优化（以吉利德为例，其花费了一年的时间将整个生产流程缩短了周）。
除了生产流程复杂，Car-T还面临生产周期长以及成本高昂的问题。Car-T产品为针对每个病人个体定制化的产品，每一批产品都需要使用异质化的病人独立的T细胞，每一批产品的生产都需要严格筛选，从T细胞的分离转导激活，到后续的灌封质检运输，再到最后回输给病人，流程长且复杂，大约会消耗2-4周不等（Yescarta平均约7天、Kymriah22天、Juno将提交BLA的Liso-cel24天）。Car-T本身是一种新型的复杂的生物产品，产品的质量控制和监测是生产的重中之重，也具有较大的挑战和困难，这使得Car-T的生产场地更像实验室而有别于传统生产设施，其GMP验证十分困难，这些因素都使得Car-T成本高居不下，其中生产材料以及QA\QC费用占比极高。
敏感性分析：最大的成分来自血液分离，一次性用品和病毒，病毒载体的成本估计在最理想情况下仅占4-5％。但是当病毒载体工艺产量不佳时对成本影响极大。
假设是建立在诺华7万平方英尺的细胞生产车间每年能生产批，且达到满产的情况。若病人数低于，则成本可能会提高至0.6w美金
Car-T生产还需要有强大的上下游整合能力。Car-T疗法产业链中，上游为流式细胞仪等设备生产商，用于T细胞分选、转染等步骤的试剂，及细胞因子等原、辅料。首先就是慢病毒的生产，如何实现高效的生产慢病毒，并实现慢病毒生产工艺的稳定放大，是行业普遍面临的难点也是生产企业受制的一大因素。目前全球仅有Oxford、BioMedica等几家企业，具有病毒载体制备的核心技术，和稳定的规模化生产工艺，并且得到监管机构的认证。以诺华为例，其病毒供应就依赖于供应商Oxford。
而在中下游产业链中，除了产品的研发生产以及稳定的冷链运输网络构建，Car-T公司需要承担在学术界、生物技术和医学界的推广责任。这些逻辑都可以从国际知名巨头在基因治疗产业的布局中得到印证。例如，辉瑞收购Bamboo和Vivet并与SparkTherapeutics和Sangamo合作，建立了一个腺相关病毒（AAV）平台，同时进行大量内部投资（超过5亿美元用于生产部分）。Sarepta通过许可来自学术机构和较小的生物技术公司（包括Nationwide医院，Myonexus，Lysogene和Lacerta）的一系列资产来建立其渠道，同时与Brammer，Paragon和Aldevron等公司一起开发制造外部网络。
受限于本文篇幅，本报告不对Car-T产业链的生产工艺尤其是质粒和病毒载体开发生产重点描述，我们后续将就书写相关报告。
最后，我们不难看出，规模化生产能力与上下游网络的建立以及降低生产成本是Car-T领域现阶段竞争的核心之一。由于Car-T具有平台技术的特点，能够形成“赢者通吃”的动力。快速的形成申报与规模化生产能力，并且在快速抢占市场的过程中与医生、运输渠道形成稳定关系是现阶Car-T企业抢占市场的首要选择。而后续生产成本的降低，则可以通过例如引入更多CDMO/CMO企业、全自动化生产、γδT细胞的研究深入、UniCar、CarNK、基于mRNA、DNA和转座子/转座酶的电转系统等实现。
孤棹自迟从蹭蹬
Car-T商业化有困难，但也充满展望
市场目前较为担心Car-T产品的销售不及预期，商业前景难以支撑整个Car-T市场估值。年，两款Car-T产品虽然较年录得38%的涨幅，但近3个季度销售增速放缓，以YesCarta为例，其在美国及欧洲销售近三季度有所反复，基本维持在同一水平。市场上投资者普遍认为一款有前景的新药应该在上市前几年各季度均保持极高增速增长，而看衰Car-T的产业前景，尤其是吉利德在年计提了部分Kite的投资损失，市场的担忧情绪普遍加重。我们认为Car-T作为一种跨时代的细胞治疗方法，其转产与扩产复杂性、医院推广及医生教育、医保支付等方式完全有别于传统化药与大分子生物药，综合分析各影响Car-T销售的因素，我们认为Car-T市场前景仍然向好，市场应当对这种全新的细胞疗法更多的耐心。
目前Car-T是对一个前所未有的产品销售与推广，无论医保方、医疗提供方还是患者都是一个全新的接受与认知过程，市场也还需要对其复杂性逐步认知。医院数量以及医生使用Car-T尤其是商业化Car-T产品的积极性对于产品销售额有显著影响，并且些变量又受到多个其他因素的影响。
有资格开展Car-T医院数量对产品销售有影响
市场普遍没有意识到有资格实施Car-T医院资源对于Car-T销售的重要性。FDA强制要求Car-T细胞只能在经认证的中心进行使用并由经过培训的医生（HCP）提供，而占美国医疗机构较大比例的肿瘤门诊尚不能提供。目医院的血液和骨髓移植（BMT）部门提供，医院也会建立专门针对细胞疗法的队伍（成员多为原白血病或淋巴瘤小组），同时Car-T护理交付工作（特别是患者使用资格的审核评估与输注后的管理）又需要跨专业的工作组，医院必须原先就拥有极强的综合医疗水平和护理能力；Car-T需要细胞疗法专门的数据和质量管理团队进行数据报告和法规监控，并且注射中心必须满足FACT（a，b）和FDA（）的监管法规要求。整个治疗过程从细胞收集，储存，运输和接收都有既定流程和数据要求，医院的基础科研能力以及信息化能力提出了极高的要求，因而在Car-T推广中，医院作为弥足珍贵的资源对于Car-T产品的放量尤为重要。
从历史数据中我们可以发现，拥有Car-T医院数量与Car-T销售额之间高度相关，两者之间增长率额基本保持一致。然后，我们用计量模医院数进行小样本估计。其中，Yt+:t+期的Car-T销售额。Xt:t医院数。回归结果如下，模型显著，拟合度较好。
我们对得到的结果做格兰杰因果检验。由于经典回归模型要求数据必须是平稳的，但是这个数据具有明确趋势性，所以考虑证明协整来证明数据间的长期均衡，防止伪回归的现象。Hos医院数量。ADF检验发现sale是一阶单整，hos是二阶单整，对hos进行差分处理使其变为一阶单整，然后利用johansen检验验证其是否存在协整关系，结果：d(hos)与sale具有长期均衡关系。
现有数据无法进行格兰杰因果分析，原因是格兰杰因果检验要求两组序列同为平稳序列，对现有数据进行二阶差分会同时减少样本量，医院数进行差分后无法与原本的实际意义联系起来，所以只证明到两变量存在均衡关系。
综上，医院数量对Car-T销售额的影响是有意义的，但受限于数据量较少，两者间的未来一段时间内的关系仍有待观察。
现有的美国医保政策影响医生选择Car-T的积极性
我们发现在Car-T的绝对疗效以及学术追求的驱动下，医生有较强的使用动力，医院对于商业化Car-T仍处于低水平使用阶段，主要受制于医院处于亏损状态和临床医生有相对更多的将患者转到临床的选择。
目前的市场还没有充分医院使用Car-T积极性的影响。一来是由于美国医保尤其是Medicare和Medicaid的复杂性，二来是Car-T疗法尚处在积极进入各国医保的阶段，市场更为
