NK/T细胞淋巴瘤（NKTCL）为一种侵袭性和异质性非霍奇金淋巴瘤，与EBV感染密切相关。为了基于基因组结构改变和EBV序列状态界定NKTCL分子分型，上海交通大医院上海血液学研究所国家转化医学中心赵维莅教授团队对例新诊断的NKTCL活检样本进行了多组学分析，该研究定义了NKTCL三种主要的分子亚型，这些分子亚型在细胞来源、EBV基因表达、转录学特征、对基于天冬酰胺酶（ASP）治疗和靶向治疗反应四方面具有显著差异。研究提示其中的TSIM分子亚型对PD-1单抗治疗更为敏感，为PD-1单抗治疗提供重要理论依据。研究确定了与EBV相关发病机制的分子网络，为NKTCL治疗提供潜在临床策略。结果发表在新一期Cancercell杂志上（XiongJ,etal.CancerCell.Mar16;37(3):-.e6）。
主要亮点1）多组学整合分析为NKTCL分子分型提供洞见；
2）EBV裂解基因在NKTCL发病中发挥重要作用；
3）基于基因组改变的分子亚型与临床结果相关；
4）MYC、组蛋白乙酰化和PD-L1/2是NKTCL潜在的治疗靶标。
不同细胞来源NK/T细胞淋巴瘤的遗传学特征基于37例患者全基因组测序（WGS）和63例患者全外显子测序（WES）检测数据，研究发现：NK/T细胞淋巴瘤更偏好错义突变和G/CA/T改变，见图A。
研究者检测了58种在肿瘤中具有预测功能（SNV、INDEL和CNV）改变的候选基因，包括RNA解旋酶家族基因（DDX3X和其他19种基因，44/），肿瘤抑制基因（TP53，12/;MGA，8/），JAK-STAT通路基因（STAT3，22/；STAT5B，9/；STAT5A，9/；JAK2，11/；JAK3，3/），表观遗传修饰蛋白基因（例如KMT2D，15/；KMT2C，16/；KMT2B，5/；KDM6A，5/；TET2，6/；ASXL3，7/；SETD2，5/；BCOR，9/；NCOR2，6/；EP，9/；HDAC9，10/；ARID1A，8/）和RAS-MAPK通路基因（例如，NOTCH3，6/；PRKD1，5/；KRAS，6/；BRAF，8/，MAP3K5，9/，EPHA1，13/，PPFIA2，5/；PTPRK，10/）。值得注意的是，所有患者都具有上述五类基因突变，提示基因组异常在NKTCL发病机制中发挥重要作用。见图B。
94例患者的CNV研究结果显示：最常见的染色体异常为染色体6q21缺失（del6q21，16/94，17％）。13例患者（amp9p24.1/PD-L1/2基因座，13/94，14％）具有反复出现的9p24.1扩增，该片段扩增在HL中能上调PD-L1/2表达。与复发突变有关的染色体片段包括：9p24.1/JAK2基因座扩增（amp9p24.1/JAK2基因座，10/94，11％），17q21.2/STAT3/5B/5A基因座（amp17q21.2/STAT3/5B/5A基因座，8/94，9%），6q22.33/PTPRK基因座（amp6q22.33/PTPRK基因座，7/94，7%）以及Xp11.4/BCOR基因座缺失（delXp11.4/BCOR基因座，5/94，5%）。杂合性缺失（LOH）最常见于3p21.31/RHOA基因座（16/94，17%）、12q24.12-24.13/PTPN11/MAPKAPK5基因座（9/94，10%）和1p22.1/BRD基因座（6/94，6%）。见图C。
研究者通过检测TCR重排情况来区分NK细胞和T细胞。结果显示：TCR重排阴性的NKTCL具有STAT3（26%，18/70）、DDX3X（23%，16/70）、KMT2C（18%，13/71）、JAK2（16％，11/71）、KMT2D（16％，11/70）、EP（11％，8/70）、STAT5B（11％，8/71）和STAT5A（10％，7/70）的频繁突变/拷贝数变异（CNVs），而TCR重排阳性的NKTCL伴有EPHA1（26％，6/23）、TP53（18％，4/22）、ARID1A（17％，4/23）、PTPRQ（14％，3/22）、NCOR2（14％，3/22）、PPFIA2（14％，3/22）、BCOR（14％，3/22）、PTPRK（14％，3/22）和HDAC9（13％，3/23）的频繁突变/CNVs。见图A。
对于CNVs改变来说，仅在TCR阴性的NKTCL中检测到amp9p24.1/PD-L1/2基因座（16％vsTCR阳性NKTCL的0％，p=0.）。就功能分类来说，JAK-STAT通路基因改变在TCR阴性NKTCL中显著增加（p=0.），而RAS-MAPK通路基因改变在TCR阳性NKTCL中显著增加（p=0.，图B）。
研究者随后建立了一种定量NK细胞和T细胞相关基因表达的方法，基于该方法，研究者对例NKTCL患者进行RNA-seq分析，分析结果将这些患者基于细胞来源不同分为：NK细胞来源（n=53）和T细胞来源（n=49），见图C。
与基因座改变相关的分子亚型研究者基于RNA-seq数据的聚类分析结果，发现NKTCL具有三种与基因组改变相关的分子亚型，包括TSIM亚型（56例，基于JAK-STAT通路和TP53中突变，以及amp9p24.1/JAK2基因座、amp17q21.2/STAT3/5B/5A基因座、amp9p24.1/PD-L1/2基因座和del6q21）、MB亚型（18例，基于MGA突变和1p22.1/BRDTLOH）以及HEA亚型（28例，基于HDAC9、EP和ARID1A突变）。
从分子亚型与细胞来源相关性来看，TSIM亚型患者比MB亚型（中位数6.3；范围4.1-7.8；p0.）与HEA亚型患者（中位数6.6；范围4.8-8.3；p0.）相比，具有显著更高的NK细胞基因表达（中位数为7.6；范围为5.8-9.0）。HEA亚型患者比TSIM（中位数8.9；范围7.9-9.6；p0.）和MB亚型（中位数9.2；范围7.4-10.2；p=0.）患者具有显著更高的T细胞基因表达（中位数9.7；范围8.7-10.7）。
就分子亚型特征来说，TSIM亚型的JAK-STAT突变/扩增（p0.）和amp9p24.1/PD-L1/2基因座（p=0.）显著富集于NK细胞基因谱一侧，但在TP53突变和del6q21方面具有相似的趋势。MB亚型的MGA突变（p=0.）和1p22.1/BRDTLOH（p0.）显著富集于基因谱的中间。HEA亚型的HDAC9（P0.）、EP（P=0.）和ARID1A（p=0.）突变显著富集于T细胞基因谱一侧，见图D。总的来说，NKTCL的分子亚型与细胞来源相关。
NKTCL分子亚型的EBV模式NKTCL肿瘤突变负荷（TMB）为3.3个突变/Mbp，显著低于另一种侵袭性淋巴瘤DLBCL（18.4个突变/Mbp），但与EBV相关的NPC（4.5个突变/Mbp）和GC（3.1个突变/Mbp）相当，这提示EBV在NKTCL疾病进展中的潜在作用。
为了研究EBV的基因组多样性，研究者收集了来自不同地区人群（亚洲，n=42；非洲，n=35；欧洲，n=18；北美，n=9；大洋洲，n=21；未分类，n=1）的个EBV株的完整基因组，疾病类型有NPC，n=27；BL，n=19；GC，n=16；HL，n=8；传染性单核细胞增多症（IM），n=6;移植后淋巴细胞增生性疾病（PTLD），n=19；自发性淋巴样细胞系（spontaneouslymphoidcelllines，sLCL），n=30；和未分类的，n=1。
系统发育分析和EBV序列覆盖率/SNVs比较结果显示：NKTCL和亚洲NKTCL或NPC的EBV序列有相似性（更高的序列覆盖率/较少的SNVs），这为NKTCL在亚洲人群中的地理流行特点和常见的鼻/副鼻区受累提供遗传学证据。见图A。
作为RNA-seq数据中表达最高的EBV基因，BALF3（GR和TA）中EBVSNVs经常在NKTCL中检测到（均为93.5％，见图B），这显著高于从其他EBV相关疾病EBV中分离的EBV病毒株（GR：61.3％，p=0.；TA：60.4％，p0.）。
研究者对三种分子亚型患者的EBV转录本进行了研究，结果观察到不同的模式，见图C。MB亚型具有较低水平的潜伏LMP1基因，这与之前在BL报道的潜伏期I感染的情况相类似。HEA亚型显示潜伏期II模式和具有更高水平的裂解基因BNRF1，该基因编码的蛋白是一种潜在EBV感染所需的DAXX相互作用蛋白。TSIM亚型也具有潜伏期II和更高水平的裂解基因BALF3。研究者采用RT-PCR在所有例患者样本中进一步证实了上述LMP1、BNRF1和BALF3与分子亚型的相关性，见图D。
与LMP1和BNRF1不同，BALF3功能作用尚不清楚。因此，研究者将WTBALF3转染进NK-92细胞（WGS未检测到EBV序列）。免疫荧光检测结果显示：与对照组相比，BALF3在NK-92细胞中异位表达会增加DNA损伤标志物γH2AX和53BP1核水平，但上述DNA损失标志物在LMP1和BNRF1过表达情况下未增加，见图E。在临床上，根据染色体断裂（chromothripsis）状态和突变数量不同，将基因组不稳定性分为高度、中度和低度。与低度基因组不稳定的相比，BALF3水平在高度和中度患者中增加（见图F）。这些结果表明BALF3过表达可能导致NKTCL中的DNA损伤，进一步导致NKTCL基因组的不稳定。
NKTCL分子亚型的临床意义研究者选择一组接受了以天冬酰胺酶（ASP）为骨架治疗方案的NKTCL患者，采用新分子亚型对这些患者的OS和PFS进行了分析，结果发现：三种分子亚型在OS和PFS存在显著差异。与TSIM亚型（PFS：p=0.，OS：p=0.）和HEA亚型（PFS：p=0.，OS：p=0.）相比，MB亚型预后较差，见图A。TSIM、MB和HEA亚型的预计3年OS率分别为79.1%、38.5%和91.7%。就AnnArbor分期来说，这三种分子亚型在I-II期患者中没有观察到PFS和OS的显著差异，见图B；但在III-IV期患者中，MB亚型预后较差（TSIMvsMB：对于PFS，p=0.，对于OS，p=0.；MBvsHEA：对于PFS，p=0.，对于OS，p=0.），见图C。
在多因素分析中，当控制IPI、PINK或PINK-E时，分子亚型是PFS和OS的独立预后因素（见图D）。
基于NKTCL分子亚型的靶向治疗正如RNA-seq所揭示的，分子亚型在致癌信号通路基因表达特征、免疫调节和细胞代谢过程存在差异（图A）。
TSIM亚型主要涉及致癌信号通路JAK-STAT（JAK3和STAT1-5）的激活、NK细胞相关免疫反应相关通路（例如NK细胞介导的毒性，包括GZMB、KIR2DL1/2/4、KLRD1、KLRC1-3和NCR1/3）、抗原加工和递呈（HLA分子）、以及PD-L1/2过表达和基因组不稳定。MB亚型（图B）显示原癌基因MYC及其主要下游靶基因MAP3K6的过表达，以及多种致癌信号通路的上调，包括MAPK（MAP3K4/6/13，MAP4K3），NOTCH（NOTCH3/4）和WNT（WNT2/9A/9B/11）。HEA亚型（图B）以组蛋白伴侣DAXX以及转录因子MEF2C的过表达，MEF2C基因在组蛋白乙酰化中发挥作用。
MGA突变和BRDTLOH是MB亚型的两个关键因素。从功能上讲，MGA分子沉默导致MGA表达显著下降（图A，左）、MYC表达增加（图A，右）以及增加细胞集落形成（图B）和细胞侵袭（图C）。MGA小发夹RNA（shRNA）在转染的细胞中激活上皮间质转化（EMT），下调上皮标志物E-钙黏蛋白和上调间质标志物纤维连接蛋白和波形蛋白（图D）。BRDT异位表达转录水平诱导MYC表达（图E和F）和增强的EMT（图G）。由此可见，MGA突变和BRDTLOH可能参与肿瘤播散以及与临床结果不佳相关。
基于测试队列和验证队列的RNA-seq数据，PD-L1表达与JAK-STAT、NK细胞介导的细胞毒性作用、抗原加工和递呈途径显著相关（图C，上）。MYC与MAPK、NOTCH和WNT通路显著相关（图C，中）。DAXX与NF-κB和TCR通路显著相关（图C，下）。93例NKTCL患者标本的免疫组化分析结果显示：PD-L1表达阳性率在TSIM亚型中最高（p=0.），MYC表达阳性率在MB亚型中最高（p=0.），DAXX表达阳性率在HEA亚型中最高（p=0.），这提示PD-L1、MYC和DAXX是分子亚型的潜在标志（图D）。
此外，研究者构建了模拟三种分子分型的临床前，用以研究潜在的靶向治疗手段。NK-92细胞在含有IL-2的培养基中生长，因此NK-92为JAK-STAT依赖性的TSIM样细胞系。在TSIM样模型中，为了模拟体内情况，NK-92细胞与外周血单个核细胞共培养，当用PD-1单抗pembrolizumab进行处理时，与WTTP53细胞相比，TP53突变细胞诱导CD3+/CD8+T细胞中Ki-67的表达增加（TP53RQ：p=0.和TP53RH：p=0.），但NK-92细胞生长降低（TP53RQ：p=0.和TP53RH：p=0.）（图C）。
在MB样模型中，转染了MGAshRNA的SNK-6和NK-92细胞系显示对MYC抑制剂高三尖杉酯碱（homoharringtonine，HHT）灵敏度增加（SNK-6：24hIC50p=0.和48hIC50p0.；NK-92MGAshRNA：24hC50p=0.和48hIC50p=0.，与转染scramble对照的NK-92细胞相比。图D，左）。体内斑马鱼异种移植模型显示：在MB样MGAshRNA组里，HHT治疗后显著延长存活期（p0.，图D，右）。
在HEA样模型中，表达EP的SNK-6和NK-92细胞系对组蛋白去乙酰酶抑制剂西达本胺更敏感（SNK-6：24h和48h的IC50p0.；NK92：24h和48h的IC50p0.，与vector对照相比。图E，左）。在体内，斑马鱼异种移植物模型显示：在HEA样WTEP组中，西达本胺治疗延长存活期（p0.，图E，右）。
小结基因组学和转录组学分析结果表明：NKTCL具有不同的分子亚型。NKTCL病理学改变与治疗干预之间的联系可能能指导将来基于机制的治疗选择。
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