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惠恩夫（加州大学圣地亚哥分校）、赵阳兵（宾夕法尼亚大学）
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CAR-T疗法是通过在患者自身T细胞上表达嵌合型抗原受体（ChimericAntigenReceptor,CAR），使其在体内识别并杀伤肿瘤细胞的一种肿瘤免疫疗法。CAR-T疗法已在血液癌中展现出令人瞩目的疗效，并批准用于治疗急性B淋巴细胞白血病以及特定类型的非霍奇金淋巴瘤。
然而作为一种新的疗法，CAR-T治疗也有其局限性。越来越多的临床数据显示，高达30%-50%的CAR-T疗法治疗的患者会出现肿瘤复发现象，并且其中大多数病人会在接受CAR-T治疗后一年内出现复发。
导致肿瘤的复发原因有多种，其中CAR-T细胞的体内持续能力（invivopersistence），即CAR-T细胞在患者体内存活时间的长短，是一个决定性的因素。在急性淋巴细胞白血病以及慢性淋巴细胞白血病临床研究中都发现，CAR-T疗法的疗效和CAR-T细胞的体内持续能力呈正相关性。
因此，探索CAR-T细胞的体内持续能力的调控机制已成为当下的研究热点。
年8月5日，上海科技大学王皞鹏研究团队与中科院分子细胞科学卓越创新中心许琛琦实验室，以及复旦大医院吴海涛课题组合作在Immunity上发表了题为ChimericAntigenReceptorDesignedtoPreventUbiquitinationandDownregulationShowedDurableAntitumorEfficacy的研究论文，通过研究CAR受体蛋白在CAR-T细胞中运输降解的调控机制，设计了一种新型的可循环CAR，显著地提高了CAR-T细胞的体内持续能力和抗肿瘤效果，为防止CAR-T治疗后肿瘤的复发提供了新策略。
已有研究表明，抗原的结合往往会引起抗原受体的内吞和降解，这是调控免疫细胞活性的一种机制。CAR作为一种人工设计的抗原受体是否有同样的现象呢？
为了探索这个问题，研究团队通过小鼠肿瘤模型，比较了下面两种环境中CAR-T细胞的表面CAR的表达：高肿瘤抗原表达的肿瘤微环境和无肿瘤抗原表达的外周淋巴器官（图1）。
研究发现相比于外周淋巴器官中CAR的正常表达，肿瘤微环境中高表达的肿瘤抗原会导致CAR受体的显著下调，从而抑制CAR-T细胞的抗肿瘤能力。
图1肿瘤微环境中CAR-T细胞表面CAR受体表达显著下调
研究团队进一步研究了CAR受体下调的分子机制发现：静息的CAR-T细胞上，CAR受体们并不是静止不动的，而是不停的被内吞(internalization)，内吞的CAR受体又会被送回细胞表面（recycling），从而达到一个动态平衡；当肿瘤抗原出现时，这种稳态会被打破。
肿瘤抗原的结合导致CAR受体蛋白的快速泛素化，导致内吞的CAR受体不再回复到细胞表面，而是输送到溶酶体（lysosome）进行降解,致使CAR受体的下调。
为了阻断这个过程，研究团队把CAR受体胞内的泛素化位点赖氨酸K突变成精氨酸R（CARKR），从而阻断了CAR泛素化以及后续的溶酶体降解。CARKR无法被降解，CARKR可以更多的返回到CAR-T细胞表面，因此研究团队将这种全新的设计命名为可循环CAR（RecyclableCAR）。
图2肿瘤抗原介导CAR下调的分子机制
可循环CAR有2个特点：1.由于抗原介导的CAR下调被抑制，可循环CAR能够长时间的保持CAR的表达，从而具备长效的杀肿瘤能力（图3A）；2.若把可循环CAR的设计方案应用到现在临床批准的CD19-41BBCAR上，可以大幅度增强其体内持续能力。
当把同样数量的野生型CAR-T和可循环CAR-T细胞输入荷瘤小鼠，可循环CAR-T细胞在体内存活的更好，40天后其数量是野生型CAR-T细胞的倍左右（图3B）。这些都赋予了可循环CAR-T细胞强大的抗肿瘤效果（图3C）。
图3可循环CAR-T细胞的疗效
进一步研究发现由于激活的可循环CAR没有降解，大量聚集在胞内内体（endosome）中。而此时CAR胞内段的4-1BB结构域仍然结合着传递4-1BB信号的TRAF2分子，形成了可以在胞内继续传递信号的信号小体（signalosome）（图4）。
4-1BB的下游信号随之被增强，进而促进T细胞代谢重编程（提高线粒体的生成及氧化磷酸化代谢），以及促进中央型记忆T细胞的分化和T细胞的体内存活/增殖能力。
值得一提的是，这是领域首次观察到CAR受体可以在T细胞中内体上进行信号转导（EndosomalCARsignaling）,这将帮助我们更好地认识CAR信号转导的分子机制，为将来CAR设计的优化提供新的思路。
图4可循环CAR形成更多的signalingendosomes
综上所述，该研究发现肿瘤抗原可以引起CAR泛素化以及溶酶体介导的CAR降解，导致细胞表面CAR受体的下调。通过阻断CAR泛素化，新型的可循环CAR设计可以有效地增强CAR-T细胞的长效杀肿瘤活性，同时大幅度地提高CAR-T细胞体内持续能力，从而增强其抗肿瘤的疗效。
重要的是，可循环CAR的设计方案仅需在原有CAR分子的胞内区引入几个氨基酸的突变，对于识别肿瘤的胞外区以及稳定CAR表达的穿膜区保持不变。因此，可循环CAR的设计为现有的靶向各种肿瘤的CAR-T疗法提高疗效，防止复发，提供了一种简单易行而广谱的解决方案。
专家·点评
惠恩夫（UCSD，助理教授）
作为免疫系统抗肿瘤的“战士”，T细胞依靠其表面抗原受体（Tcellreceptor，简称TCR）识别肿瘤抗原，进而通过下游的信号分子激活T细胞，分泌细胞毒素和细胞因子，从而杀死肿瘤细胞。然而，很多肿瘤由于无法被天然的TCR有效识别，而得以逃逸免疫系统的攻击。为了解决这个问题，人们利用基因工程技术为T细胞装上嵌合型抗原受体（ChimericAntigenReceptor,简称CAR）。这些受体的胞外端是一段可以识别肿瘤抗原的结构域，胞内端通常包含TCR的CD3活化基序和共刺激受体（CD28，4-1BB等）的活化基序。改装后的T细胞(CAR-T)可以更有效的识别并消灭肿瘤细胞。尽管CAR-T疗法对于血液系统恶性肿瘤已经取得了显著效果，但也有明显的缺陷。比如有些病人对CAR-T疗法没有响应；而且即使在应答较好的B细胞淋巴瘤病人中，有接近50%的应答病人会在一年内复发。在这些复发的病人中，CAR-T细胞数量大大减少或者失去功能，其背后的原因并不清楚。因此，增强CAR-T疗法的持续性是当前免疫疗法的一个关键问题。王皞鹏/许琛琦/吴海涛团队的这篇发表在IMMUNITY杂志的出色工作，令人信服地揭示了限制CAR-T持续性的关键机制——CAR的泛素化（ubiquitination）。基于该机制，作者进而突变了CAR上的泛素化位点，设计出一种稳定持久的CAR，并且在老鼠肿瘤模型中证明这种新式CAR可以大大增强CAR-T的抗肿瘤能力并延长CAR-T细胞在体内的寿命。这一成果有望简洁高效改进CAR-T疗法，解决免疫疗法中的一个重大问题。类似于细胞上的很多受体，人工合成的CAR不仅存在于细胞表面，还可以被内吞（endocyse或internalize）到内膜上，然后通过膜运输（membranetrafficking）再次回到细胞表面，这个被称为循环回收（recycling）的过程可以动态调节CAR在细胞表面的表达量。另有体外研究表明，CAR-T和肿瘤细胞结合之后，CAR在细胞表面的表达量会降低，进而削弱CAR-T攻击肿瘤细胞的能力。但这种现象的生理意义有待确认。另外，肿瘤细胞降低CAR表达量的机制还不清楚，内吞作用是否是唯一的途径尚不得而知。王皞鹏等的这篇IMMUNITY论文证明，CAR在结合肿瘤抗原后会很快被泛素化，这些被泛素化的CAR会被送到溶酶体（lysosome）降解，进而阻断内吞CAR回到细胞表面。作者接着证明，将CAR上的泛素化位点赖氨酸（K)突变成精氨酸（R)就可以抑制CAR的降解，提高内吞CAR返回细胞表面的几率，进而增强CAR-T杀伤肿瘤细胞的能力。他们将这种无法被泛素化的CAR命名为可循环CAR(recyclableCAR)。令人惊喜的是，在小鼠模型中，带有这种recyclableCAR的T细胞可以完全清除普通CAR-T无法清除的K血癌细胞。作者进一步发现，除了更强的杀伤能力，含有recyclableCAR的T细胞在体内有更强的持久性，因为它们比普通CAR-T增殖更快，更容易形成“长寿”的记忆性（memory）T细胞。分子机制上，recyclableCAR能够特异性地增强4-1BB/TRAF2/NF-kB共刺激信号通路，但对CD3/ZAP70信号通路影响很小。有的是，相比于普通的CAR-T细胞，recyclableCAR-T胞内有更多含有4-1BB/TRAF2复合体的内体（endosome），证据表明这些内体放大了4-1BB信号通路，进而增强CAR-T的代谢能力和线粒体功能。这也是国际上首次关于CAR可以在内体继续传导信号的报道。综上所述，该项研究通过生化手段发现了导致CAR降解和限制CAR-T持续性的基本机制，并在此基础上设计出一种新型的抗降解CAR，进而在动物模型中证明新型CAR-T具有更强大而持久的抗肿瘤能力。这项令人印象深刻的工作再次证明基础研究的重要性和其对免疫疗法的指导意义。该项研究发现也启发了一些新的思考：01研究广泛的K48位的多聚泛素化通常导致蛋白酶体（proteasome）介导的降解，但该研究证明泛素化的CAR是通过溶酶体降解的。那么CAR的泛素化是什么类型？由什么泛素连接酶E3介导？这个E3可否作为改善CAR-T功能的靶标？02先前的研究发现少数受体（例如NGF）可以通过内体上的受体进行信号转导(endosomalsignaling)。文中证据显示内体信号对4-1BBCAR-T功能的重要性；然而内体信号对于其他种类的CAR-T功能的重要性仍不得而知。03临床上，CAR-T疗法目前对于实体瘤的效果不明显，而CAR-T细胞在病人体内不能长时间的存活也是局限CAR-T治疗实体肿瘤的因素之一。可否利用文中提出的recyclableCAR来改进对实体瘤的疗效？这些问题的答案有待进一步研究揭晓。
赵阳兵(宾夕法尼亚大学，副教授)
CAR-T细胞治疗对于多种B细胞恶性肿瘤具有良好的疗效。年，两款以CD19为靶点的CAR-T细胞产品获批上市。各种针对其他适应症的CAR-T临床实验也正在如火如荼的进行中。然而，大量临床数据表明，有相当一部分患者在接受CAR-T细胞治疗后发生肿瘤免疫逃逸现象，导致复发或治疗无效。肿瘤细胞可采用多种方式逃避CAR-T细胞的攻击。例如，肿瘤微环境抑制CAR-T细胞的活性或者导致CAR-T细胞耗竭。同时，肿瘤细胞也可以通过丢失CAR-T细胞所识别的肿瘤抗原来达到免疫逃逸。因此，理解肿瘤细胞在肿瘤微环境如何与CAR-T细胞进行相互作用并完成免疫逃逸可以提高CAR-T治疗效果及帮助我们解决CAR-T治疗后肿瘤复发的问题。上海科技大学王皞鹏研究团队与中科院分子细胞科学卓越创新中心许琛琦实验室，以及复旦大医院吴海涛课题组合作研究发现了一种肿瘤免疫逃逸的新机制。在肿瘤微环境中存在着大量的肿瘤抗原，不停的刺激CAR-T细胞，导致CAR-T细胞表面CAR受体大量下调。CAR表达的下调导致CAR-T细胞肿瘤杀伤能力受损，抑制CAR-T细胞体内的存活和增殖，从而引发了肿瘤细胞的免疫逃逸。针对这个机制，研究团队设计了一个新型的抵抗CAR表达下调的“可循环CAR”。研究表明受体的泛素化往往介导受体激活后的下调和降解，阻断受体的泛素化可以减低受体的下调和降解。可循环CAR的本质是一种无法被泛素化的CAR。在体外实验中，可循环CAR-T细胞比野生型的CAR-T细胞有更强的肿瘤杀伤能力。在小鼠实体肿瘤模型中，野生型的CAR-T由于免疫逃逸，无法清除肿瘤；相比野生型的CAR-T细胞，可循环CAR-T细胞在小鼠体内增殖/存活的更好，并且形成更多记忆T细胞，从而可以有效的清除肿瘤。这些实验数据为验证可循环CAR-T疗效的临床实验提供了坚实的基础。
制版人：琪酱
参考文献
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