原发性骨癌相对稀少，但可发生在各年龄段，包括骨肉瘤，Ewing肉瘤和软骨瘤。传统治疗方法通常为化疗、手术、放疗相结合，收效甚微，为病情的进一步发展留下空间。而且，这些肿瘤基因学特点揭示可用靶点寥寥无几。在此背景下，近期癌症免疫学研究进展在治疗原发性骨癌方面提供了一线希望。癌症免疫学治疗方法主要包括刺激天然抗肿瘤T细胞产生和获得性输入肿瘤特异性细胞毒T细胞。CAR-T细胞属于后者，结合了T细胞生物学和基因工程学研究前沿。本片综述中，我们简要描述CAR-T细胞方法和其在原发性骨癌中的应用。
引言原发性骨癌相对稀少，在儿童和少年癌症患者中占比大约3%。其中以骨肉瘤和Ewing肉瘤较为常见。骨肉瘤每年患病率为百万分之4.8，大家一致认为其起源于间充质干细胞。大多数骨肉瘤与机体零星突变有关，尽管TP53\RB1\REQL4在繁殖突变中非常常见。大多数骨肉瘤患者染色体高度不稳定，这不仅与早期放射有关。骨肉瘤通过新的佐剂局部化疗，外科手术切除并且术后化疗可使5年生存率提高到60-70%。但骨肉瘤转移后生存率下降至不足20%。将近20%病人在确诊时已发现转移，其中90%转移入肺。尽管诸如Ezrin、Notch和HER2等分子靶点一直进行着研究，当前针对骨肉瘤却没有什么靶点进展。
Ewing肉瘤是仅次于骨肉瘤的第二大原发性骨癌，也可起源于软骨组织。Ewing肉瘤以病理性染色体异位为特征，形成融合致癌基因，属于肉瘤类。Ewing肉瘤染色体异位发生在22号染色体EWSR1基因，与ETS家族转录因子成员融合。经过多手段治疗（手术、放化疗），原发性Ewing肉瘤的5年生存率是60-70%，转移或复发情况下5年生存率降低至30%。是否发生转移是诊断Ewing肉瘤的最重要指标，大约25%的就诊病人已发生转移。种系和肿瘤测序表明EWS-FLI/ERG融合基因在Ewing肉瘤中是唯一的基因改变，如此使靶位治疗变得困难。尽管如此，仍在进行着通过使用小分子抑制物YK-4-靶向EWS-ERG融合蛋白的努力。胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)途径在Ewing肉瘤中发生紊乱，被作为潜在治疗靶点进行研究。
软骨瘤是一类发展迟缓的原发性骨癌，其特征为软骨细胞的癌变。骨肉瘤和Ewing肉瘤在儿童和青少年多发，软骨瘤在成年人多发。多数软骨瘤（80-90%）风险等级较低，当发生明显转移时，10%变为高危，生存率很低。软骨瘤主要治疗方法是手术切除，放化疗对于生存率提高没有任何效果。原发性软骨瘤原位始发，而继发性软骨瘤起源于已存在的良性软骨瘤，如软骨瘤或骨软骨瘤。已经报道了软骨瘤罕见变体，包括去分化、间充质和透明细胞软骨瘤。已经报道了各种亚型特异性遗传改变，包括IDH1/2突变，COL2A1突变和hedgehog信号通路失调。
尽管科学家仍在努力寻找用于治疗原发性骨恶性肿瘤的药物分子靶标，但在不久的将来似乎没有人能够改变该肿瘤的治疗模式。免疫疗法为癌症治疗提供了一种替代方法，引起了科学家很大的兴趣。值得注意的是，癌症免疫治疗的第一个案例就关系到骨肉瘤，这可以追溯到多年前。WilliamB.Coley（-）医院的外科医生，他将细菌或细菌产物（Coley毒素）注射入癌症患者体内，用以刺激免疫反应，尤其在骨肉瘤中，收效明显。尽管该方法没有得到继续使用，但癌症免疫治疗的最新进展表明该工作的基本前提是正确。为此，Coley博士被誉为“癌症免疫疗法之父”。除人类病例外，还有报道犬骨肉瘤术后感染对机体生存有积极影响。尽管有证据表明免疫反应对控制肉瘤发展有积极作用，但无论在临床前还是临床研究中，针对肉瘤的免疫治疗明显落后于其他类型的癌症。
免疫系统可以检测到肿瘤并与其发生反应，但癌症（恶性肿瘤）可以阻断这种免疫反应。肿瘤免疫反应起始于树突状细胞处理肿瘤相关蛋白，用以激活淋巴结T细胞反应，而后抗肿瘤T细胞作用于肿瘤发挥溶瘤作用。肿瘤可以阻断其中的一或多个步骤来阻碍免疫反应。抗肿瘤T细胞在高突变肿瘤中天然产生，但通过各种免疫检查点在肿瘤微环境中他们是失活的。在这种背景下，使用如抗PD1/PDL1和抗CTLA4免疫检查点阻断剂可以达到惊人的治疗反应。然而，诸如大多数原发性骨癌等低突变肿瘤，很少自发产生抗肿瘤T细胞。免疫检查点阻断剂在这些肿瘤中可能不那么有效，这一观点在最近一些肉瘤实验中对免疫检查点阻断剂的低反应而得到证实。通过基因工程方法改造T细胞，使其可识别非突变的肿瘤相关抗原，通过过继细胞疗法治疗这些肿瘤是极具吸引力的替代方案。
癌症的过继T细胞疗法T细胞（T淋巴细胞）可以通过由α和β链组成的T细胞受体（TCR）识别抗原。αβ异二聚体进一步与其他蛋白质结合形成多亚基跨膜复合物，其将抗原识别与下游信号传导联系起来。然而，仅当靶细胞抗原以主要组织相容性复合物（MHC）形式呈现为8-11个氨基酸的肽片段时，αβ-TCR才能识别并与该抗原反应。CD8T细胞识别MHCI类（由所有有核细胞表达）呈递的抗原，而CD4T细胞识别MHCII类呈递的抗原（由专门的抗原呈递细胞表达）。肿瘤杀伤性T细胞通常是细胞毒性（或杀伤性）CD8T细胞，其识别肿瘤细胞表面上由MHCI类呈递的肿瘤相关抗原。癌症中的过继性T细胞疗法基于将肿瘤特异性自体T细胞输注到患者体内。过继转移的T细胞是活的药物，并且可以在体内显著扩增并形成记忆T细胞，其可以在人体中存续数十年。过继性T细胞免疫治疗的早期尝试基于从患者肿瘤（肿瘤浸润淋巴细胞或TIL）中分离天然存在的肿瘤反应性T细胞，离体扩增它们，并将它们回输患者体内。然而，许多肿瘤不会含有抗肿瘤T细胞，或者它们可能非常罕见。因此，通过基因工程赋予T细胞抗肿瘤特性是一种更有效的方法。
图1：TCR复合体和CAR的示意图
（A）主要组织相容性分子（MHC）上的抗原（Ag）与由αβ异二聚体组成的TCR结合。TCR与CD3结合形成TCR-CD3多亚基信号复合物。CD3复合物由γ，δ，?和δ成分组成，包含酪氨酸活化基序（ITAM）。TCR与MHC肽复合物的结合会启动信号传导级联，涉及其他辅助蛋白的募集和激活，最终导致基因表达变化。（B）三代CAR构建体。细胞内结构域（ICD）由包含ITAM的CD3δ链组成。在第二代和第三代CAR中分别添加一个或两个共刺激分子（CS）。CS1可以衍生自CD27，CD28，OX-40或4-1BB。第三代CAR中的其他共刺激分子（CS2）可以源自OX-40或4-1BB。避免使用同一CS串联，以使CS1和CS2在第三代CAR中是不同的。（C）CAR-T细胞的遗传修饰可以增强CAR-T细胞在肿瘤细胞中的运输，持久性和活性。实例包括表达CCR2受体以增加肿瘤归巢和表达白介素12以增强杀肿瘤活性。
目前有两种人工设计抗肿瘤特异性T细胞的方法。“转基因TCR”（tgTCR）方法基于在T细胞中强制表达具有对抗原-MHC-1复合物具有确定特异性的“合成”TCR。该方法的优点是能够靶向肿瘤表达的任何蛋白质（胞核，胞质或胞膜）。另一方面，主要障碍是MHC的高度多态性和基于相关MHC-I分子和靶抗原的共表达来选择患者的要求。当抗原由一种MHC等位基因呈递被TCR识别后，该TCR不会识别被另一种MHC等位基因呈递的该抗原，因此限制tgTCR只能对表达特定MHC等位基因的少数患者有效。该方法的其他重要问题包括合成αβ链与内源αβ的错配和合成tgTCR的不一致表达。虽然超出了本综述的范围，但仍有一些策略可以解决这些限制。最近tgTCR方法在滑膜肉瘤（靶向NY-ESO-1）和黑色素瘤（靶向NY-ESO-1，MART-1和gp-）方面取得的成功已经证明这是过继性T细胞治疗的可行策略。实际上，最近使用与SLLMWITQC/HLA-A*02复合物反应的新型tgTCRc靶向NY-ESO-1抗原的临床试验显示，在患有复发/转移性滑膜肉瘤的年轻成人中ORR为50％。使用tgTCR的临床试验的最新列表可以在别处找到。
在T细胞中设计抗肿瘤特异性的第二种方法是本综述的重点，它将抗体的抗原识别特性与T细胞激活功能相结合，因此被称为“嵌合抗原受体T细胞”或“CAR-T细胞”。与TCR不同，CAR不需要MHC并且可以直接识别和结合在细胞表面上表达的靶分子。然而，它只能检测细胞表面上表达的蛋白质。我们将在下面讨论该技术的细节，即优势和劣势。
CAR-T细胞基础癌症免疫治疗CAR分子为合成融合蛋白，由外部抗原识别区、铰链区、跨膜区和内部信号区组成。通过血液分离得到病人T细胞，一般采用病毒载体将CAR基因插入T细胞基因组中。将CAR-T细胞在体外进行扩增而后回输入病人体内。细胞外抗原识别结构域通常是针对目标抗原的单链可变片段（scFv），尽管也可以使用与目标蛋白质结合的配体或肽。scFv的可变部分由免疫球蛋白的重链和轻链组成，并通过柔性接头连接。尽管scFv通常来自小鼠或人源化单克隆抗体，但也可以使用噬菌体展示文库进行合成和筛选。理想的抗原识别结构域应对靶抗原具有高亲和力和特异性，并显示低免疫原性。选择合适的靶抗原至关重要，理想情况下，应选择一种蛋白质，该蛋白质应（1）位于质膜上；（2）在癌细胞上高水平表达，以确保具有靶向作用；（3）在正常组织上最低表达降低靶点上的非肿瘤毒性；（4）对于癌细胞着实有效而避免抗药性。目前使用的抗原靶标分为两种类型：（1）仅在癌细胞中表达的突变蛋白类肿瘤特异性抗原；（2）在癌细胞中高表达或仅在癌细胞中表达的非突变蛋白类肿瘤相关抗原。在这种情况下，CD19是在患有各种血液系统恶性肿瘤的患者的恶性B细胞以及正常B细胞上表达的一种非突变的细胞表面蛋白。Tisagenlecleucel（Kymriah?，Novartis）是一种CD19定向基因修饰的自体CAR-T细胞免疫疗法，于年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗患B细胞前体急性淋巴细胞白血病，且属难治性或二次以及更晚期复发的不超过25岁的患者。此外，FDA批准了两种针对CD19的CAR-T细胞免疫疗法产品，包括年的Axicabtageneciloleucel（YescartaTM，KitePharma）以及Tisagenlecleucel（Kymriah，Novartis），用于治疗复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤，已经过两种或多种全身治疗的成年人。在DLBCL中，已报告的缓解率为64-86％，其中持久性完全缓解为40-50％，而在B细胞ALL中，成人缓解率为83-93％，儿童为68-90％。统计数据证实了CAR-T细胞免疫疗法在癌症治疗中的能力和前景。
铰链区将识别抗原的胞外域与CAR的跨膜部分相连接，并且通常衍生自CD8α，CD28或IgG的Fc段。铰链的长度和组成根据抗原靶标的不同将影响CAR-T细胞的功能和运输。同样，跨膜结构域的组成将影响CAR在T细胞表面的稳定性及其效应因子的释放能力。因此，铰链和跨膜结构域不仅仅是将抗原识别结构域连接到细胞内信号传导结构域的系链。但是，关于最佳设计的一般原则尚未得出，目前必须对设计变量进行经验检验。
与天然T细胞非常相似，CAR-T细胞的最佳杀肿瘤活性需要：（1）抗原识别（2）共刺激信号（3）适当的细胞因子环境。多年来，CAR结构胞内信号域（ICD）经过多次完善，可以最好地整合这些原理。第一代CAR使用CD3δ作为ICD，而第二代和第三代CAR分别具有一个或两个额外的共刺激域。共刺激结构域通常来自CD28，CD27、4-1BB，ICOS或OX40。与CAR胞外域结合的抗原导致CD3δICD磷酸化和激活，从而激活CAR-T细胞。第二代和第三代CAR中的其他共刺激分子进一步调节下游信号传导，以优化CAR-T细胞的功能，扩增和体内持久性。实际上，由于第一代CAR在体内的持久性有限，因此已很少使用。大多数方法都使用第二代和以后的CAR构造。确定最佳CAR设计参数是一个快速发展的研究领域。更多的努力还在探索如何通过其他基因改造，可以提高CAR-T细胞向实体瘤的运输，提高其对肿瘤细胞的活性，增加体内持久性，并降低其对非肿瘤细胞的毒性。我们将在本文的后续部分中进一步讨论这些方面。
除了CAR结构的设计，体外扩增CAR-T细胞的方法以及CAR-T回输病人前的准备也会对CAR-T细胞的体内持久性和效力造成影响。当前体外扩增采用延迟T细胞分化并诱导干细胞样特性方法。例如，已证明体外扩增阶段添加IL-7，IL-15或IL-21有利于增强体内持久性。目前，大多数方案都包括在CAR-T回输前进行化疗以清除淋巴细胞。淋巴细胞清除后可以为转移的T细胞（CAR-T，tgTCR或TIL）提供良好的免疫环境，有利于其在体内扩增，存活和发挥活性。具体机制尚不清楚，可能与减少了参与T细胞扩增所需的细胞因子竞争以及清除了调节性T细胞和其他抑制性免疫细胞有关。CAR-T细胞疗法依然是一种新的治疗方法，该技术仍在发展完善，各步骤的最佳参数仍需摸索。
CAR-T细胞在骨肿瘤免疫治疗中的作用由于原发性骨肿瘤通常表现出较低的突变，并很少出现天然抗肿瘤T细胞，因此通过接种疫苗或过继性T细胞转移（tgTCR或CAR-T）方法比ICB可更有效诱导新T细胞反应。在这里，我们着重讨论CAR-T方法，由于针对CD19的CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤中获得成功应用，CAR-T方法近年来引起了人们的
