具体方法参阅第三

三、临床意义

二、研究方法

2.固有层t淋巴细胞固有层t淋巴细胞(lamina propria lyphocyte, lpl)分散在固有层,约占固有层免疫细胞总数10%左右其中cd4阳性细胞(cd4lpl)显著多于cd8阳性细胞(cd8lpl)40%cd4lpl表达cd45ro抗原,能产生大量il-2、il-4和γ-inf,为记忆性t淋巴细胞,能辅助b细胞转化成抗体产生细胞并促其分泌抗体60%cd4lpl表达cd45ra和cd8抗原,能直接抑制抗体产生细胞转化和分泌这两种细胞的比例在调节 抗体分泌中起着重要作用cd8lpl也可以分两种:一种表达cd28抗原的lpl,能淋巴瘤原因通过adcc或直接溶解靶细胞另一种表达cd16抗原,具有自然杀伤功能lpl能被il-2激活,激活的lpl能释放大量il-2、il-4、γ-inf和il-5、il-2又能激活lpl,起着自身分泌作用il-5能促进抗体产生细胞分泌抗体

(3)染色方法的选择:因抗原较微量,而且位于细胞膜,应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性t淋巴细胞,我们推荐最好采用pap或abc染色技术具体方法参阅第三,四章

[1] [2] 下一页

第四节 胃肠道粘膜t淋巴细胞

(1)抗体的选择:根据不同目的选择相应的抗体,如要对人胃肠道组织进行研究,可选用okt系统单抗;对鼠类等进行研究可选用leu 或t看淋巴瘤哪个医院好hy系列如要研究辅助性t淋巴细胞可用okt4或cd4;研究抑制性t淋巴细胞可用okt8或cd8等单克隆抗体

1.组织切片中t淋巴细胞80年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中t淋巴细胞研究,特异性较差免疫组化染色中应注意以下几个方面:

3.胃肠道相关淋巴组织t淋巴细胞胃肠道相关淋巴样组织(gut – associated lymphoid tissue, galt)主要包括肠系膜淋巴结和粘膜中集合和散在淋巴滤泡galtt淋巴细胞多们于生发中心的外周部位,约占40%其中cd8和cd4阳细胞比例与周围血相似动物研究证明,肠系膜淋巴结内的cd4阳民生细胞多于固有层分子生物学研究发现galtt淋巴细胞含有il-4和il-5基因嗜铬细胞瘤霍奇金淋巴瘤,激活后产生大量il-4和il-5,能特异性增加b和t淋巴细胞增殖抑制b淋巴细胞分化其表面糖蛋白主要为cd45ra和leu8(cd8),证明是幼稚t淋巴细胞它们对抗原刺激的增殖反应低,对刀豆素a等有丝分裂促进剂的增殖反应高,产生il-2和γ-inf低,辅助作用弱galtt淋巴细胞如何调节 b淋巴细胞转化成iga产生细胞和其它免疫细胞的增殖及功能,并不十分清楚有待进一步研究

(7)阳性细胞为细胞膜上有绿色荧光,有的呈颗粒样,随细胞滚动荧光镜下可计算200个淋巴细胞中阳性细胞所占的百分率,或根据血细胞计数板中阳性细胞算出细胞总数及百分率

(3)匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛(只允许淋巴细胞滤过,除去粘液、碎屑和上皮细胞凝集块)或金属网(200目)获得淋巴细典型霍奇金淋巴瘤胞悬液

近年研究发现,除m细胞和巨噬细胞外,胃肠上皮细胞在接受和传递抗原中也起重要作用免疫细胞化学发现正常小肠上皮细胞微绒毛和侧膜有斑片状mhc ii类抗原,人小肠为hla-dr糖蛋白,能识别、加工和传递抗原使粘膜内t淋巴细胞产生免疫反应hla-dr表达受γ-ifn诱导因此免疫反应中组织相关性抗原与iel和lpl淋巴细胞互相进行调节

1.上皮内t淋巴细胞上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte, iel)是指位于上皮层基底部的t淋巴细胞近年来,对iel对邻近上皮细胞有压迹,位于两个上皮细胞交界处,并未进入上皮细胞内近年来,对iel研究非常深入已经证实75%以上肠iel是tc霍奇金淋巴瘤致意事项rγαβ阳性细胞,说明它们来源于胸腺,接受过抗原刺激其中大部分为诱导、杀伤性t淋巴细胞(cd8或okt8阳性),10%左右为cd7阳性和cd3阴性的iel,类似nk细胞,有细胞毒作用,但无nk细胞标记,对nk的靶细胞无破坏作用10%～20%左右为tcrδ阳性iel,不受胸腺的影响,其中70%cd4和cd8均阴性,为t淋巴细胞前体说明人的部分iel通过胸腺外途径进行分化内毒素等腔内抗原与肠上皮细胞微绒毛、肠腺隐窝细胞、巨噬细胞和树突状细胞膜上的组织相关性抗原分子(鼠为mhl-ii,人为hla-dr、hla-dp和hal-dr)相结合后,将抗原分子传递到cd3阳性t淋巴细胞受体(t lymphocyte receptor, tcr)中的α和β亚单t细胞淋巴瘤严重吗位可变区进行结合,在cd8分子作用下导致iel增殖和分泌大量γ-干扰素(γ-inf),α-肿瘤坏死因子(α-tnf),和少量的白介素-2(il-2),发挥细胞毒性作用,调节 上皮细胞再生和增强对食物抗原的耐受

(2)上皮层放在无镁离子、含100u青霉素和链霉素及0.2%叠氮纳的pb中清洗,无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎,用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞

(2)组织加工方法选择:目前所研究的特异性t淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上,用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏,应采用新鲜组织和低温处理具体方法是:手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻,或用oct复合物包埋后再放入液氮中,便于切片,cryostat冰冻切片后室关于嗜铬细胞瘤温下风干,用4℃纯乙醇或丙酮固定10min,pbs冲洗后即可进行免疫细胞化学染色

一、t淋巴细胞分布及其特点

(5)试管内加0.1ml细胞液后加okt系列单抗0.1ml,同时用另一试管加0.1mlpbs作对照混合液在4℃放置30～60min(也可以在冰箱过夜)后,pbs(含rpmi)冲洗3次,离心后细胞沉淀物再加pbs至0.1ml

1.iel在胃肠道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空肠100个上皮细胞有20个iel,回肠有13个,结肠只有5个,这也可能是恶性肿瘤不发生在小肠的重要因素之一我们发现胃粘膜也有iel在胃部炎症和溃疡时,上皮及腺体隐窝细胞间的iel明显增加iel不但参与免疫反应,而且通过伪足与上皮细胞接触,加速上皮细胞再生电镜下胃粘膜也发现这种现象iel血管免疫母细胞t细胞淋巴瘤与乳糜泻(coeliac disease, cd)关系最密切近期研究表明,第12型腺病毒与麦胶蛋白有同源性cd病人肠道感染这种病毒后,服用麦胶数小时粘膜中iel显著增加在上皮细胞hlaii抗原糖蛋白分子作用下与tcr结合,激活tcrαβlel,发挥细胞毒作用,导致肠粘膜萎缩,引起脂肪吸收不良和腹泻等一系列临床症状增加的tcrγδiel调节 tcrαβ的杀伤作用停服含麦胶食物后,tcrαβiel明显减少,上皮细胞再生恢复,临床症状消失cd病人出现疣状胃炎也是iel参与的免疫反应结果cd病人的肠道淋巴瘤也是来自iel增殖器官移植后的宿主排异反应、结肠炎、热带性腹泻、牛奶过敏和某些自身免疫性疾病均有iel增边缘带b细胞淋巴瘤加也有人发现克隆氏病和溃疡性结肠炎患者结肠iel细胞毒性作用明显减弱当然,iel增加是继发或是原发,是否iel是这些疾病的病因,临床治疗和诊断价值如何,还不清楚而且iel受年龄、抗原、免疫调节 剂(考的松对iel无影响,环磷酰胺显著降低iel数量)等因素影响,

胃肠道t淋巴细胞分布在上皮层、固有层、粘膜集合和散在淋巴滤泡及肠系膜淋巴结内随着免疫细胞化学技术广泛应用和各类t细胞亚群单克隆抗体的制备成功,为进一步研究不同部位t淋巴细胞的分类和功能起极其重要的作用

(6)加0.1mlfitc标记的抗鼠igg(根据工作效价),4℃放置20～30min,pbs洗3次,离心后加在红细胞计数板上,荧光显微镜观察

2.粘膜分离液中t淋巴细胞一定重继发淋巴瘤量粘膜组织中分离出来的t淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究下面介绍用间接免疫荧光技术研究iel的大致过程:

(4)将硅化玻璃球高压消毒,冲洗和平衡后将悬浮液过柱,得到的细胞液直接计数也可以用淋巴细胞分离液提取,用台盼蓝测定其活性,并加10%fcs-rpmi细胞培养液,淋巴细胞数应达5×106/ml

(1)将手术取得的肠管纵形剪开,将上皮层与固有层分离