导读
淋巴瘤是血液系统的恶性肿瘤，通常由淋巴结（LNs）发展而来。在淋巴瘤中，非造血细胞（NHCs）的活动，包括间充质基质细胞和内皮细胞可促进淋巴瘤的发生并有可能作为治疗靶点。在淋巴瘤中未受侵袭的淋巴结NHC异质性改变尚未被系统研究，因此淋巴瘤NHC的研究远远落后于其他实体肿瘤。
在淋巴结中，根据形态和拓扑定位确定的NHCs主要亚群包括血管内皮细胞、淋巴内皮细胞和非内皮基质细胞。尽管最近对NHC异质性的研究使用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，但人类淋巴结BECs和NESCs仍需在单细胞分辨率上进行全面分析。
为了解决这一问题，日本筑波大学研究团队使用scRNA-seq构建了淋巴结和淋巴瘤中的人类NHCs图谱。目的是发现之前未被在人类淋巴结中识别的NHC异质性，以确定淋巴瘤细胞对NHC生态位的整体影响。相关的研究成果于年3月24日在线发表于NatureCellBiology杂志上。
实验流程
流程1：实验方法流程
流程2：样本分组和分析流程
内容结果
1.主要NHC成分的单细胞图谱
为了揭示人类淋巴结（LNs）和淋巴瘤中的NHCs，研究团队对9名肿瘤患者的无肿瘤细胞浸润的LN样本和10名患者的结状滤泡性淋巴瘤样本中提取的NHCs进行了scRNA-seq和数据整合（图1a）。UMAP显示三种主要的NHC成分（BECs、LECs和NESCs）和三种污染的造血细胞成分（淋巴细胞、浆细胞和树突状细胞，图1b）。另外，MFLNs和FL样本中NHCs的分布比较相似（图1f）。这项研究首次构建了MFLNs样本中NHCs的单细胞图谱。
图1LNs和FL样本中NHC成分单细胞图谱
2.NHC主要细胞群的重聚类分析
对MFLNs样本中血管内皮细胞（BECs）进行重聚类发现了动脉、毛细血管和静脉BECs（图2a）。静脉BECs在MFLNs中最常见，其次是毛细血管和动脉BECs（图2b）。对BECs的进一步无监控聚类揭示了10个转录上不同的亚群，动脉、毛细血管BECs均有3个亚群，静脉BECs包含4个亚群（图2e），每个亚群显示超过个差异表达基因。作者对不同亚群的marker基因及差异表达基因进行了详细的展示（图2c-d）。
图2Asingle-cellatlasofhumanLNBECs?
对MFLNs样本中淋巴内皮细胞（LECs）进行重聚类分析发现了8个亚群，并将本研究中发现的亚群与近期报道的LEC细胞图谱进行了比较。同样地，对MFLNs样本中非内皮基质细胞（NESCs）进行重聚类分析发现了12个亚群，差异表达分析提供了这些亚群的一些新的标记基因。
图3BECs细胞亚细胞群的主要分析结果?
3.FL基质的组成和转录变化
作者通过将滤泡性淋巴瘤（FL）样本中NHCs与无转移性淋巴结（MFLN）样本的进行比较，以寻找在NHCs亚群水平上的变化（图4a）。总体而言，与MFLN相比，FL中BECs的比例显著增加，而LECs的比例则下降。此外，在FLBECs中，动脉亚群的比例增加。
对FL和MFLN样本中NHCs亚群进行差异表达分析，发现最大的差异在MRCs中，其次是TRCs和SMC亚群等（图4b）。作者对NHCs各细胞亚群中主要的差异基因也进行了详细展示。
图4FL与MFLN样本中NHC成分的细胞比例和表达差异?
4.FL基质中细胞间相互作用
为了评估在FL发展过程中的NHC和恶性B细胞的相互作用，作者对9例FL样本低温贮藏CD45+细胞进行scRNA-seq获取恶性B细胞的基因表达信息。进而利用CellPhoneDB分析FL中NHC亚群和恶性B细胞内配体受体之间的相互作用。
作者一共鉴定了58种相互作用，包括一些之前在FL中未被描述的相互作用。在几个LEC亚群中，TNFSF10介导的促进癌细胞死亡的相互作用显著上调，这表明LECs可能抵抗淋巴瘤的发展。在NESCs中，与TNF信号通路、细胞黏附、PDGF信号通路和趋化因子信号通路相关的相互作用在亚群间被激活（图5a）。
图5FL样本中基质与恶性B细胞相互作用解析
基于上述的相互作用分析结果，团队接下来寻求一种可能在淋巴瘤中被靶向的相互作用。研究将重点放在CD70和CD27相互作用的功能验证上，以验证基于图谱的分析的有效性，并提出一种在基质中与FL进展相关的潜在机制。
首先利用免疫荧光染色证实了CD70在FL髓质和外膜基质细胞中过表达（图5b-c）。另外，在5个CD27+FL样本中，4个与重组人CD70-Fc蛋白明确结合。在所有4例病例中，使用抗CD27功能阻断抗体处理细胞显著抑制了恶性B细胞与CD70-Fc蛋白的结合（图5d-e）。接下来，使用FL冷冻切片和恶性B富集细胞进行了体外细胞黏附实验。黏附于髓质区的恶性B细胞数目在抗CD27抗体处理后显著降低（图5f-g）。
5.FL中基质来源的预后标志物
为了找到临床相关的NHC单细胞marker，将NHCs中的生态位特异性或亚群特异性改变与FL患者的生存期关联起来。作者使用了包含个FL样本生存信息的bulk微阵列数据集。将多变量分析的候选基因缩小到了7个（LY6H、LOX、PTGIS、TDO2、REM1、PIEZO2和CHI3L1），这7个基因在FL造血细胞中表达水平最低，但与MFLN对应的细胞相比，在FLBEC或NESC亚群中表达水平较高。假设它们可能与不良预后相关（图6a），在多变量分析中，细胞标记物LY6H和LOX以及TDO2和REM1的表达增加与不良预后相关，即使在调整了预后指数之后（图6b）。对于这四个基因，分别对MFLN和FL样本进行IF染色。与MFLN相比，FL中表达LY6H、LOX、TDO2或REM1的细胞增加。
图6FL中基质来源的预后标志物的发现
总结展望
本研究的局限性包括样本的数量，可能不足以识别所有的NHC亚群，包括无法精确确定转录组数据中的NHC异质性与患者特征（如基因组改变）之间的相关性。其次，不能完全排除这种可能性，即当前单细胞图谱受到远处恶性肿瘤未知因素的影响。第三，当前研究没有分析其他淋巴瘤亚型或非淋巴瘤疾病。最后，需要进一步的功能验证，以确认当前的发现与每个NHC亚群相关。
这项研究从27个人类样本中收集了超过,个NHCs，包括LNs和各种淋巴结淋巴瘤（包括其它的淋巴瘤样本），构建了一个单细胞转录组图谱，揭示了30个不同的亚群，包括一些以前未被识别的亚群。值得注意的是，该图谱对淋巴瘤NHCs的比较分析非常有用，它揭示了滤泡性淋巴瘤NHCs中基因表达的亚群特异性变化以及与恶性细胞的相互作用。这有助于我们对淋巴瘤间质重构的理解，并突出了潜在的临床生物标志物。该研究在很大程度上更新了人类LNs的NHC分类和疾病状态分析，并为LN和淋巴瘤生物学提供了丰富的资源和更深入的见解，以推进淋巴瘤的管理和治疗。
参考文献：1.Asingle-cellatlasofnon-haematopoieticcellsinhumanlymphnodesandlymphomarevealsalandscapeofstromalremodelling.NATURECEllBiOlOgY.Drivinginnovationforbetterlife！
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