NatureReviewsCART细

撰文：知否

IF=30.；

推荐度：★★★★★

亮点：

1、阐述了CAR-T细胞疗法近3年来在癌症治疗中取得的主要研究进展和前景，以及其有效性和安全性

2、讨论了CAR-T细胞疗法的毒性和耐药性的机制，以及克服这些挑战的新的工程和药物干预，结合新的研究和技术

3、讨论了一系列有前途的新靶点和适应症，以及可能对CAR-T细胞治疗未来产生重大影响的制造创新

近年来，CAR-T细胞疗法因其高度的特异性以及强大的抗肿瘤免疫功能被广泛应用于各种恶性肿瘤的实验研究和临床治疗，不仅在血液系统肿瘤领域取得了较大突破，在实体肿瘤中同样被认为最有前景的肿瘤治疗方式之一。近日，发表在《NatureReviewsCancer》上的一篇综述就详细的介绍了CAR-T细胞治疗研究的最新进展及其所面临的主要问题。

第一代CARs由于缺乏共刺激因子，不能转导增值信号和诱导细胞因子产生，缺乏抗肿瘤效应。于是，科学家将CAR进行了改造，增加了一个共刺激分子或者可诱导共刺激分子，将传递第信号的CD28或41BB分子的活性域整合到CAR中，在抗肿瘤的同时完成自身扩增，增加体内存活时间。第一批B细胞白血病患者用第二代靶向CD19的CAR-T细胞，彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗。第三代CARs包含了两个共刺激分子，提高T细胞的杀伤能力。但是这种CAR-T细胞输注是把双刃剑，改造后的增殖过度可引起致命性CRS（细胞因子风暴）。因此最新提出了第四代CARs（也被称为TRUCKs），在此基础上将额外的分子原件插入到CAR中以表达功能性转基因蛋白，例如诸如白细胞介素基因的功能原件，可以提高杀伤能力，或者是调控开关、自杀基因，以提高CAR-T疗法的安全性和可控性。（图1）。

FDA批准的CAR-T细胞是患者的自体细胞，可以避免异基因排斥或移植物抗宿主病(GvHD)的问题，但需要单独定制生产。所以什么是最好的CAR-T细胞仍然是一个有争议的问题。临床数据已经确定疗效与CAR-T细胞的增殖，生存和记忆表型相关，所以避免或延迟T细胞衰竭被认为是一个关键目标。CLL患者中对CAR-T细胞有完全应答的患者，其CD8+T细胞的线粒体生物发生增强，利于CAR-T细胞的增殖和生存；而CD8+T细胞的T细胞激活受损的CLL患者因葡萄糖摄取减少则对癌细胞的反应率较低。这表明CAR-T细胞的增殖和生存能力对治疗至关重要。而进一步的CAR-T细胞扩增研究中，虽然单个CAR-T细胞克隆已经扩增，但依然导致了延迟的抗肿瘤反应。TET2，SOCS1，TCEB2或ELOB，以及RASA2和CBLB这些基因的破坏导致对肿瘤细胞增殖和体外细胞毒性的增强，从而产生强大的抗肿瘤反应。除此之外CAR-T细胞中病毒整合位点在细胞信号传导和染色质修饰通路中促进增殖的编码蛋白的基因插入突变。基于这些数据，研究者能够创建一个基于载体整合位点预测临床结果的模型。除了增强CAR-T细胞的增殖能力，限制它们的衰竭也有利于抗肿瘤反应。T细胞研究已经表明，强烈的T细胞激活会导致疲惫，因此人们已经做出了一些努力来调节CAR信号来缓解疲惫。抗原和CAR分子密度都对疗效有很大的影响，两者的低表达有助于有限的抗肿瘤反应。用不同的连接子、铰链和跨膜结构域、共刺激、ITAMs25和启动子调节CAR信号通路都会影响CAR的功能，这取决于肿瘤抗原的数量。共激活的差异，连接不同共激活分子结构域的CAR-T细胞具有不同的激活能力，除CD28和4-1BB外，各种共刺激结构域已与CD3信号通路联合用于CAR-T细胞治疗，但是这种差异的分子机制尚不清楚。

出现的毒性机制与CAR-T细胞治疗相关的两个显著的临床毒性是CRS和神经毒性，在临床转化之前动物模型都无法预测。CRS通常体现在患者在进行CAR-T细胞治疗第一周发热、低血压和呼吸衰竭血清细胞因子水平高(图2)。虽然神经毒性已被临床证实与CRS有关，但其机制似乎是不同的。总的来说，具有4-1BB共刺激域的CARs似乎比具有CD28域的CARs造成的神经毒性和CRS更少。患者的严重神经毒性与脑脊液(CSF)中高水平的促炎细胞因子(如IL-6、IL-8、CCL2和CXCL10)有关。尽管有这些观察，但神经毒性的机制目前还不清楚。作者推测促炎细胞因子的增加可能会激活大脑血管系统的内皮细胞，导致通透性和毛细血管渗漏区域的增加(称为血管源性水肿)，表现为局灶性水肿和神经毒性另一种可能的解释是脑壁细胞表达CD19，并且靶向CAR-T细胞有针对这些细胞的活性造成神经毒性。临床上克服CRS的主要治疗方法是通过IL-6受体单克隆抗体tocilizumab治疗。糖皮质激素也常与tocilizumab联合使用，以减少脑内炎症和血管源性水肿。

设计预防或减轻CRS的新策略的挑战之一是小鼠建模固有的局限性。文中作者讨论了目前几种最为接近人类CRS的小鼠模型各自的优势与弊端。在临床前模型和临床试验中，除了IL-6受体阻断外，其他管理毒性如IL-1受体拮抗剂和敲除GM-CSF的干预措施正在研究中。Anakinra目前正在进行临床测试，以预防接受CAR-T细胞治疗的患者的神经毒性。除了细胞因子干预，其他研究表明用酪氨酸阻断儿茶酚胺可以保护小鼠免受CRS的致命并发症。其他研究小组也试图控制通过使用达沙替尼来控制CAR-T细胞的负载和效价，在不杀死细胞的情况下过阻止LCK磷酸化和激活T细胞核因子(NFAT)诱导来限制CAR-T细胞的增殖和细胞因子的释放，可以在临床环境中暂时关闭CAR-T细胞。

耐药机制CAR-T细胞治疗后复发的一个常见机制是抗原丢失(图3)。同时也可能有额外的因素导致耐药性，如CART细胞衰竭。癌细胞的一个死亡信号通路导致癌细胞抗原持续存在，进而损伤T细胞功能导致耐药性。在CAR-T细胞治疗领域的大多数经验都是在血液恶性肿瘤的背景下，肿瘤微环境(TME)被认为在反应中起作用要小得多。然而，随着该领域超越CD19靶向CAR-T细胞到实体肿瘤，抑制性TME也可能产生对CAR-T细胞治疗的耐药性。

综上在CAR-T细胞治疗过程中为提高临床治疗效果，在CAR-T的应用中仍需要克服重重阻力。1）克服抗原逃逸，最直接的方法是开发针对其他抗原的CAR，这些抗原可以串联或串联使用；2）克服T细胞的衰竭，开发和发展组合治疗，包括延长T细胞功能和限制衰竭；3）克服免疫抑制肿瘤微环境，TME中抗炎细胞因子和细胞增加贩运和限制抑制的创新方法也在开发中。包括通过分泌促炎性可溶性因子来增加CAR-T细胞的反应和重定向或规避抑制性TME。

目前CAR-T细胞治疗可能存在的新靶点和适应症有哪些？

1）多发性骨髓瘤，一种基于三个重复截短的APRIL分子的具有4-1BB共刺激的第二代CAR，以模拟蛋白质的三聚体可溶性分泌形式，它结合表面BCMA和TACI促进骨髓瘤的生长，在多发性骨髓瘤异种移植模型中，三聚体的形式比单一的APRILCAR设计具有更高的疗效。目前已确定多发性骨髓瘤的另一个靶点，即G蛋白偶联受体，也同样可以考虑用于CAR-T细胞的设计。

2）实体肿瘤：泛癌，CAR-T细胞治疗领域的一个主要问题是其在血液恶性肿瘤之外的适用性。在高抗原密度的情况下，包括髓母细胞瘤、骨肉瘤和尤文肉瘤在内的几种儿科癌症，B7-H3靶向CART细胞在体外和体内都是有效的。然而，当抗原密度较低时，B7-H3靶向CAR-T细胞的活性要低得多，这表明在临床中可能有一个有效的、无毒的B7-H3靶向CAR-T细胞治疗窗口。CART细胞是基于一种最初开发的抗体来识别Tn-糖基化足蛋白(Tn-PDPN)。肿瘤特异性识别CART细胞的基础是COSMC功能丧失突变的结果，COSMC编码一种分子伴侣，被认为是表达活性T-合酶所必需的，这是在粘蛋白型O-糖聚糖生物合成过程中半乳糖化Tn抗原的唯一酶。这种由COSMC突变引起的Tn半乳糖基化的差异模式已被证明发生在卵巢癌、白血病、乳腺癌、肉瘤和神经母细胞瘤中。近年来，针对间皮素的CAR-T细胞已被用于各种适应症，包括胰腺癌、肺癌和卵巢癌。目前正在进行一些临床试验，初步结果表明，间皮素靶向的CAR-T细胞是安全的，并有抗肿瘤活性的证据，这对CAR-T细胞治疗实体肿瘤的未来是有希望的。其他临床研究正在评估中皮素靶向CAR-T细胞治疗是否可以通过联合免疫检查点阻断来增强T细胞反应。

3）实体肿瘤：大脑，针对胶质母细胞瘤的CAR-T细胞治疗的初步临床试验针对EGFRvIII、IL-13受体α2(IL-13Rα2)和HER2(又称ERBB2)，不幸的是，由于目标抗原的丢失，疗效很低，为了克服胶质母细胞瘤中靶抗原表达的异质性，一种基于氯毒素(CLTX)肽的CAR-T细胞，即使在没有其他胶质母细胞瘤相关抗原的情况下，该肽也具有很强的抗肿瘤活性。基于RNA测序识别神经母细胞瘤的新靶点，即细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖GPC2。GPC2在神经母细胞瘤组织中高表达，但在正常组织中不高表达。使用基于吡咯烷酮(PBD)细胞毒性能力的抗体-药物结合物，在一种患者来源的神经母细胞瘤异种移植模型中，显示靶向GPC2可减少肿瘤生长。GPC2可能也是一种有效的CAR-T细胞靶点。

针对CAR-T细胞的设计和组装还能有哪些创新？

1）基因转移，基因重新编程的T细胞疗法的一个限制是使用病毒载体，病毒载体对可编码的DNA长度有有限的大小限制。在过去的十年中，转座子被探索为一种非病毒的产生CART细胞的手段。一家生物技术公司目前正在进行两项临床试验，开发了一种新的非病毒方法，通过电穿孔CRISPR-Cas9和双链DNA将DNA序列(1kb)传递到原代人T细胞基因组中的特定位点。使用这种方法，转基因的，癌症特异性的TCR被引入到TCRα位点，导致TCR工程的T细胞能够在体外和体内产生抗肿瘤反应。然而目前，这项技术仍然限制在大的遗传负荷(如大型CAR构造)，特别是临床使用。除了遗传物质传递方式的变化外，CAR-T细胞的改进制造还涉及T细胞如何在体外培养。

2）改善效应细胞类型，目前使用来自病人的异质T细胞。然而，有证据表明，T细胞的某些亚群可能比其他亚群更有效。临床试验已使用中央记忆T细胞制造CD28为基础靶向CD19的CAR-T细胞。初步结果表明，与批量制造的CD19靶向CAR-T细胞相比，这些细胞是有效的，但不一定具有更多的持久性。γδT细胞是另一个潜在的优势子集。绝大多数典型的CAR-T细胞输注产品是αβT细胞。这两个亚群都表现出等效的细胞毒性水平；然而，γδCAR-T细胞不太容易衰竭。此外，γδCAR-T细胞表达共刺激和抗原提呈分子(CD86和人白细胞抗原-DR(HLA-DR)，并已被证明在TME中向其他T细胞交叉提呈肿瘤抗原。也许最令人信服的是，γδT细胞在癌症中的浸润与良好的预后有关。

3)通用CART细胞，仍然需要一个自体细胞产品，但利用一个载体的多种抗原特异性，是分裂，通用和可编程(SUPRA)CAR与一个‘zip’系统，以调整T细胞的反应。CART细胞在细胞外表达“拉链”蛋白的一部分，具有细胞内信号结构域。然后，连接到相应的伴侣拉链上的各种蛋白质疗法可以用来改变CAR的目标和信号强度。还有一种组合方法，其中使用两个不同的zip系统，一个具有CD3ζ信号域，另一个具有共刺激（图4）。

4）异基因CAR，第三方“现成”异基因CART细胞治疗备受追捧，主要是为了提高产品的标准化、病人等待时间、物流与病人的紧迫性和成本协调。最近，还利用脐带血衍生的自然杀伤细胞，并用CD28基CD19靶向CAR逆转录病毒载体传递这些细胞。脐带血的优点是含有更大比例的自然杀伤细胞，这降低了污染T细胞导致GvHD的风险。

CAR-T细胞研究已经迅速发展到临床，现在又回到了实验室，试验结果揭示了新的疗效、毒性和耐药性机制。以及催化寻找新靶标，阐明信号传递机制和新技术的应用。CAR设计的创新，转导方法和最佳细胞类型的选择，必然会导致改善反应和改变治疗许多不同癌症类型的患者。

作者介绍

马塞拉·毛斯，医学博士，博士

医院

哈佛医学院医学助理教授

医院癌症中心细胞免疫治疗主任

癌症免疫学，会员

淋巴瘤和骨髓瘤，成员

Maus实验室有兴趣利用基因工程技术重新引导T细胞，以发现和杀死肿瘤细胞，同时保留健康组织。目标是开发新的方法来设计分子受体，将T细胞靶向液体和实体肿瘤，使用T细胞作为其他药物的传递工具，或使用药物帮助T细胞对抗肿瘤，并了解T细胞如何作为治疗癌症患者的"活药"。

实验室的目标是设计和评估下一代转基因（CAR）T细胞作为癌症患者的免疫疗法。由Maus博士指导的MGH细胞免疫治疗计划旨在将免疫学和细胞疗法领域的新发现从实验室中转化为治疗癌症患者，并通过分析免疫生物标志物并了解免疫治疗如何运作的机制、它可导致的毒性以及复发机制来向临床学习。细胞免疫治疗计划包括Maus的实验室，以及核心实验室和转译单位，以促进实验室和临床之间的联系。

参考文献：

RecentadvancesanddiscoveriesinthemechanismsandfunctionsofCARTcells

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