非小细胞肺癌多样本二代测序检测基因突变的

本文作者：陈苍宋陈振郭雪晶周建娅孙文佳方梁杰

本文来源：《肿瘤研究与临床》，年，第4期第32卷，-页.

目的

探讨非小细胞肺癌(NSCLC)多样本二代测序(NGS)检测基因突变状态的临床意义，为个体化靶向治疗提供依据。

方法

回顾性分析浙江大医院年6月至年2月收治的NSCLC患者51例，收集患者的年龄、性别、吸烟情况、病理类型、肿瘤分期、胸膜侵犯情况、脑膜侵犯情况等资料，对组织、脑脊液、胸腔积液及血浆标本行NGS检测。采用x2检验或Fisher确切概率法分析驱动基因[表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros癌基因1(ROS1)]突变状态与患者临床病理特征之间的相关性，采用CohenKappa系数分析比较不同标本间NGS检测结果的一致性。

结果

51例患者中7例送检了3种不同类型标本，其中3例脑脊液标本驱动基因突变均阳性，2例胸腔积液标本存在双基因突变。驱动基因突变多见于女性[90.48%(19/21)比50.00%(15/30)，x2=9.，P=0.]、非吸烟[80.00%(24/30)比47.62(10/21)，x2=5.，P=0.]、腺癌[72.34%(34/47)比0，P=0.]和合并恶性胸腔积液[92.86%(13/14)比56.76%(21/37)，x2=4.，P=0.]患者，差异均有统计学意义，但驱动基因突变率在不同年龄和肿瘤分期患者间差异均无统计学意义(均P0.05)。37例患者血浆标本与配对组织标本间驱动基因突变检测结果一致率为70.27%(26/37)，k值为0.，二者一致性良好。

结论

晚期NSCLC伴脑膜转移的患者行脑脊液基因检测具有较高的应用价值，伴胸腔积液患者行胸腔积液基因突变状态检测是筛选靶向治疗药物的有效手段。多样本NGS检测能更好地反映基因突变状态，可用于指导NSCLC患者个体化靶向治疗。

非小细胞肺癌(NSCLC)是我国肺癌的主要病理类型，5年生存率仅约10%[1]。多数肺癌患者在确诊时已处于晚期，失去手术机会，导致死亡率高[2]。与传统化疗相比，驱动基因阳性的患者应用相应靶向药物可使中位生存时间大大延长[3]，并可减少不良反应。目前临床上应用较广泛的驱动基因是表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros癌基因1(ROS1)等。组织标本仍是基因检测的金标准，但晚期NSCLC患者通过肿瘤组织检测驱动基因突变状态有许多局限，如标本不易获得、难于重复活组织检查且获得的样本量不足等，而恶性胸腔积液(MPE)、外周血、心包积液、脑脊液、转移淋巴结穿刺等是晚期且无法手术肺癌患者获取标本的主要途径，这些标本的获取具有可重复性强、操作风险小等特点。

研究显示大多数患者无法获取足够的标本用于基因检测，且单纯的细胞学标本仅能用于诊断的需要，无法行更多的相关检测[4]。因此多样本基因检测很有必要，其可以降低肿瘤的异质性及检测的偏差。二代测序(NGS)技术可以同时检测多个样本及多个基因，通量高，能更好地指导肺癌患者的个体化靶向治疗。本研究探讨NSCLC多样本NGS检测常见驱动基因EGFR、ALK、ROS1的临床应用价值。

1　资料与方法

1.1　一般资料

回顾性分析浙江大医院，年6月至年2月收治的51例NSCLC患者资料——其中，37例送检血浆和肿瘤组织标本，14例送检血浆、MPE标本；7例送检3种不同类型标本，包括1例送检血浆、组织和心包积液标本，2例送检血浆、组织、脑脊液标本，1例送检血浆、胸腔积液、脑脊液标本，3例送检组织、胸腔积液、血浆标本。

37例组织标本包括手术切除标本9例，气管镜活组织检查标本13例，肺穿刺活组织检查标本12例，锁骨上转移淋巴结穿刺标本2例，皮下转移包块活组织检查标本1例。37例组织标本均有血浆标本与之配对。51例NSCLC患者中，男性30例，女性21例；年龄24~81岁，中位年龄57岁；≤58岁26例，58岁25例；既往有吸烟史21例，无吸烟史30例；合并MPE者14例，未合并MPE者37例(包括原发灶34例、除MPE外转移灶3例，不包括心包积液、脑脊液)。本研究符合年修订的《赫尔辛基宣言》的要求，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2　DNA提取方法

1.2.1　组织标本DNA提取

采用QIAampDNA甲醛固定石蜡包埋(FFPE)组织试剂盒(德国Qiagen公司)提取组织FFPE标本的基因组DNA，相关实验操作严格按照说明书进行。采用Qubit3.0荧光仪配套的dsDNAHSAssay试剂盒(美国ThermoFisher公司)进行DNA浓度测定。后续用于NGS检测、甲基化检测。

1.2.2　血浆标本游离DNA提取

采集患者10ml全血至含乙二胺四乙酸三钾(K3-EDTA)的真空采血管(美国BD公司)，在采集后的2h内，于4℃、×g离心10min。将上清小心转移至新的15ml离心管，4℃、×g离心10min，取得上清，即血浆。取4~5ml血浆，采用QIAampCirculatingNucleicAcid试剂盒(德国Qiagen公司)提取血浆中循环游离DNA(cfDNA)。对提取好的cfDNA采用Qubit2.0荧光仪配套的dsDNAHSAssay试剂盒(美国ThermoFisher公司)进行DNA浓度测定。

1.2.3　MPE标本DNA提取

从MPE上清液中分离出胸腔积液细胞微丸，于4℃、×g离心10min。将胸腔积液细胞微丸进一步加工成4%甲醛FFPE细胞块，将上清液于4℃、×g进一步离心10min，去除细胞碎片，在-80℃条件下保存10ml样品，直至DNA提取。后续用于NGS检测、甲基化检测。

1.2.4　脑脊液标本DNA提取

采集患者4~5ml脑脊液至含K3-EDTA的真空采血管(美国BD公司)，在采集后的2h内，4℃、×g离心10min。将上清小心转移至新的15ml离心管，4℃、×g离心10min，采用QIAampCirculatingNucleicAcid试剂盒(德国Qiagen公司)将上清液转移到含有4~5ml脑脊液上清液的新管中，保存脑脊液沉淀物进行DNA提取。使用Qubit2.0荧光仪和dsDNAHS检测试剂盒(美国Invitrogen公司)对cfDNA进行定量。构建NGS文库至少需要50ngcfDNA。根据说明书，用QIAampDNAFFPE组织试剂盒(德国Qiagen公司)提取DNA。DNA浓度用QubitdsDNA试剂盒(美国ThermoFisher公司)测定。

1.3　NGS文库构建

用CovarisM超声破碎仪(美国科瓦利斯公司)对DNA进行剪切，然后进行末端修复、磷酸化、3端加脱氧腺嘌呤和接头连接。将连接上扩增接头的DNA用AMPureXPBeads(美国BD公司)顺磁性磁珠进行纯化，分选长度为~bp的DNA片段，采用聚合酶链反应(PCR)进行文库预扩增。扩增后的纯化产物再与靶序列捕获探针(广州燃石生物技术有限公司)进行杂交，杂交成功的片段经过特异性洗脱，再经PCR扩增后，用高灵敏度DNA试剂盒进行DNA片段大小的定量和片段长度分布测定，之后使用NextSeq测序仪(美国Illumina公司)进行双末端测序。

1.4　NGS测序数据分析

使用Burrows-WheelerAligner(BWA)软件将测序reads比对到人类基因组(UCSChg19版)。用GATK3.2、MuTect和VarScan软件分别进行局部序列比对优化、变异抓取及注释。用VarScanfpfilter软件去除覆盖深度在×以下的位点。根据ExAC、0Genomes、dbSNP、ESP6SI-V2数据库，将频率超过0.1%的变异归为单核苷酸多态性(SNP)，并排除进一步分析；其余的变异用ANNOVAR和SnpEffv3.6软件注释。使用Tophat2和Factera1.4.3软件进行DNA易位分析。基于捕获区间的覆盖深度，通过内部分析脚本检测拷贝数变异(CNV)。根据GC含量和探针设计产生的测序偏差校正覆盖率数据。利用所有捕获区域的平均覆盖率将不同样本的覆盖度标准化处理。根据肿瘤样本的覆盖深度与大量(50个)无CNV样本的平均覆盖度之间的比值计算拷贝数，作为每个捕获区域的参考。如果基因的覆盖率在数量和统计上与对照组差异有统计学意义，则称为CNV。CNV的检出限为缺失1.5、扩增2.64。

1.5　统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件分析数据。采用x2检验或Fisher确切概率法分析驱动基因突变状态与患者临床病理特征之间计数资料的相关性；P0.05为差异有统计学意义。采用CohenKappa系数分析比较不同标本NGS检测结果的一致性，k0.75为一致性好，κ≥0.4且≤0.75为一致性良好，k0.4为一致性差。

2　结果

2.1　驱动基因突变情况

NSCLC患者EGFR突变率为54.90%(28/51)，ALK融合突变率为9.80%(5/51)，ROS1突变率为3.92%(2/51)。其中28例EGFR突变患者中，第19号外显子缺失突变11例，第21号外显子突变16例，第20号外显子突变7例[第20号外显子框内插入突变1例(基因突变类型c._dupp.Ser_Aspdup)，TM突变6例]；第21号外显子突变合并TM突变4例，第19号外显子缺失合并TM突变2例。

7例送检了3种不同类型标本的患者中，3例脑脊液标本基因突变均阳性，2例胸腔积液标本存在双基因突变(表1)。

表1｜7例非小细胞肺癌患者送检的3种不同类型标本中二代测序检测3种驱动基因突变结果

2.2　驱动基因突变与临床病理特征间的关系

51例患者中，女性患者驱动基因突变率高于男性患者，差异有统计学意义(P0.05)；非吸烟患者驱动基因突变率高于吸烟患者，差异有统计学意义(P0.05)；腺癌患者驱动基因突变率高于鳞状细胞癌患者，差异有统计学意义(P0.05)；合并MPE患者驱动基因突变率高于未合并MPE患者，差异有统计学意义(P0.05)；不同年龄、肿瘤分期患者间比较，驱动基因突变率差异均无统计学意义(均P0.05)(表2)。

表2｜不同临床病理特征非小细胞肺癌患者间多样本二代测序检测驱动基因突变结果比较[例(%)]

2.3　血浆标本驱动基因突变检测的效果

送检了血浆和组织标本的37例患者中，血浆标本驱动基因突变率为43.24%(16/37)，应用其检测基因突变的灵敏度为60.0%，特异度为91.7%，一致率为70.27%(26/37)(表3)。1例患者血浆标本基因检测结果为ROS1突变，而对应组织标本检测结果为野生型。经统计分析，血浆标本与组织标本驱动基因突变检测结果间k值为0.，二者一致性良好。

表3｜非小细胞肺癌患者血浆标本与配对组织标本中二代测序检测驱动基因突变结果比较(例)

3　讨论

由于靶向治疗的巨大进展，针对驱动基因的个体化靶向治疗已成为目前晚期NSCLC患者新的有效治疗途径。肿瘤组织仍是基因检测的金标准，但大部分NSCLC患者发现时已是晚期，获得的肿瘤组织太少，且少数患者根本无法获得；由于存在肿瘤异质性，获取的病理组织也会存在选择偏倚。基于获取肿瘤组织的各种局限，行多种样本基因检测就非常有必要。

本研究显示7例患者送检了3种不同类型标本，各类型标本检测结果具有相互补充作用；1例患者血浆、胸腔积液均阴性，而脑脊液标本EGFR19缺失突变，2例患者胸腔积液标本检测到双基因突变；提示多样本基因检测更能反映肿瘤基因突变状态，能更好地指导临床用药。目前行脑脊液基因检测少有报道，Yang等[5]的研究纳入30例NSCLC患者的脑脊液样本，采用扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测EGFR突变，结果显示与组织标本相比，脑脊液EGFR基因检测的灵敏度和特异度分别为67%和82%，表明脑脊液与组织标本驱动基因突变检测结果无差异。因此，对脑膜转移的患者，由于血脑屏障等因素的存在，血液、组织标本可能无法很好地反映颅内病灶的信息，此时脑脊液标本更适宜行基因检测，且对患者的临床用药指导也更具有意义，本研究也支持这一观点。

另外，胸腔积液是晚期肺癌患者常见的并发症之一，胸腔积液标本获取容易，胸腔积液抽取对患者伤害较小，临床操作可行性强，因此对于晚期无法获得足够组织学标本的NSCLC患者，利用胸腔积液样本检测驱动基因突变状态是筛选靶向治疗药物的有效手段。Wu等[6]研究发现伴MPE肺癌者较无MPE肺癌者EGFR突变率更高，该研究显示EGFR突变率在肺癌原发灶和转移灶中不一致，这种不同甚至存在于胸膜转移灶中，而MPE中肿瘤细胞是非锚定、可自由移动的，所以可能更加同质、更能代表转移肿瘤细胞特征。

本研究显示与未合并MPE患者相比，合并MPE的患者基因突变率高，也与上述研究结果相同。目前有多项研究表明胸腔积液代替组织标本行基因检测具有可行性。魏冰等[7]获取了例合并胸腔积液的晚期NSCLC患者的病理组织和配对的胸腔积液标本，采用聚合酶链反应(PCR)进行EGFR检测，结果发现两种标本的EGFR突变检出率接近，表明胸腔积液与肿瘤组织在EGFR突变检测上有较高的一致性。因此在晚期肺癌患者中，若伴有MPE时，建议优先选择胸腔积液检测基因突变状态。

外周血循环DNA是肿瘤细胞凋亡和坏死后游离于血浆中的DNA片段，其含量与基因状态、肿瘤进展相关；肺癌在进展的不同阶段伴随着特定基因的改变，这些改变的基因片段会进入血液循环中。因此，血液标本可以反映肿瘤细胞基因突变状态。本研究中，37例血浆标本与配对组织标本基因检测结果一致性一般。Maheswaran等[8]运用等位基因特异性PCR对27例NSCLC患者的外周血进行基因学分析，并与配对的肿瘤组织的结果进行对比，两者EGFR突变率检测结果具有较高的一致性。我国何诚等[9]采用实时荧光定量PCR检测了NSCLC组织和外周血中EGFR基因突变状态，结果表明两者具有较高的一致性。提示血液标本行基因检测是肿瘤组织的良好补充。

本研究尚存在以下不足：检测病例偏少，样本数量可能不足以代表实际基因突变情况，结论可能存在一定的偏差，有待于大样本研究来验证；另外，由于有些标本送检不在同一时限，可能会影响不同标本间基因检测结果的比较。

综上所述，脑脊液、胸腔积液及血液标本获取具有微创、方便快捷的特点，是晚期肺癌患者获取标本的重要途径，多种样本行NGS检测基因突变状态可降低肿瘤异质性以及检测技术造成的假阳性和偏差，同时可及时检测出基因是否发生耐药突变，从而能更全面地指导晚期NSCLC患者的靶向治疗。

(参考文献略）